CCKBR基因条件性敲除小鼠模型

一、疾病概述

高血压是一种由环境因素、遗传因素和行为因素相互作用产生的复杂心血管症状，其中高盐摄入是最重要的环境因素之一。所谓血压的盐敏感性是指相对高盐摄入所引起的血压升高，它带来的危害不仅仅是升高血压，还能够引发脑卒中、心衰、动脉粥样硬化等并发症，并可加重胰岛素抵抗等。研究表明，盐敏感性高血压病人并发心脑血管事件的风险远远高于盐耐受性高血压病人[2]。西方发达国家一般人群中血压盐敏感者约 26%，而原发性高血压群体中血压盐敏感者约 51%；我国一般人群中血压盐敏感者 20%-30%，而原发性高血压群体中血压盐敏感者占 50-60%。因此，有效控制盐敏感性高血压对于改善我国人群健康具有重要的意义。

盐敏感性高血压的病理机制表现为钠离子吸收增多或者肾脏重吸收异常导致钠水潴留。目前抗高血压药物主要通过舒张血管和利尿改善钠水代谢的机制降低机体血压，并且利尿药物作为临床用药的首选药物，但仍有一定比例的患者没能达到控制目标。机体钠代谢的调节包括机体通过消化系统对钠的吸收和通过肾脏对钠的排出，目前高血压治疗的临床药物和对高血压与钠水代谢的研究主要集中在肾脏对钠水代谢的调节，而通过消化系统抑制机体钠的吸收可能是从根本上解决盐敏感性高血压的重要手段。本动物模型将在前期研究结果的基础上，探索胃泌素抑制肠道对钠的吸收，及其在调节钠水代谢及盐敏感性高血压中的重要作用，为盐敏感高血压的防治提供可靠的新模型和行之有效的新思路。

二、模型背景

1、造模因素信息

肠道CCKBR基因条件性敲除小鼠模型

2、实验动物背景信息

C57BL/6小鼠

3、研究背景

胃泌素(Gastrin)是一种重要的胃肠激素，它主要由胃和十二指肠G细胞分泌产生。胃泌素除调节胃肠道的分泌功能外，还能够对胰腺、小肠、肝脏、肾脏、卵巢等器官有重要的生理调节作用[1]。编码 Gastrin 的基因定位于人类17号染色体(17q21)上。GWAS分析发现，胃泌素及其受体 CCKBR（Cholecystokinin B Receptor）所在的遗传位点与高血压密切相关[2,3]。胃泌素受体基因敲除小鼠钠水代谢障碍，同时伴有血压显著升高[4]。我们首次通过人群试验发现，高血压人群餐后胃泌素水平都明显高于正常人群[5]。胃泌素受体CCKBR基因敲除小鼠（CCKBR-/-）和野生型对照小鼠，分别给予高盐饮食（6%NaCl）和正常盐饮食（0.4% NaCl），发现 CCKBR-/-小鼠高盐饮食后血压显著升高[6]。胃肠道钠水失衡能够诱发多种疾病，如高血压、心衰和肾病等。已有研究显示通过消化系统抑制机体钠的吸收可能是从根本上解决盐敏感性高血压的重要手段。

我们设计制构建的CCKBR基因肠道上皮细胞特异性敲除小鼠(CCKBRfl/fl;Villin Cre)，通过正常盐喂养，发现该小鼠血压明显升高，而对照 CCKBRfl/fl小鼠血压正常。该模型对于研究肠道靶向药物治疗盐敏感性高血压有研究意义。

参考文献

1.Koh TJ. Extragastriceffects of gastrin gene knock-out mice. Pharmacology & Toxicology. 2002; 91:368-74.

2.Levy D, Ehret GB, RiceK, et al. Genome-wide association study of blood pressure andhypertension. Nat Genet. 2009; 41: 677-87.

3. Cho YS, Go MJ, KimYJ, et al. A large-scale genome-wide association study of Asian populationsuncovers genetic factors influencing eight quantitative traits.

Nat Genet. 2009; 41:527-34.

4. von Schrenck T,Ahrens M, de Weerth A, et al. CCKB/gastrin receptors mediate changes in sodium andpotassium absorption in the isolated perfused rat kidney.

Kidney Int. 2000; 58:995-1003.

5. Jiang X, Wang W, NingB, Yang H, Liu X, Gong J, Gan F, Gao X, Zhang L, Jose PA, Yang Z. Basal andpostprandial serum levels of gastrin in normotensive and

hypertensive adults.Clin Exp Hypertens. 2013; 35(1):74-81.

6. Jiang X, Chen W, Liu X,Wang Z, Liu Y, Felder RA, Gildea JJ, Jose PA, Qin C, Yang Z. Thesynergistic roles of cholecystokinin B and dopamine D5

receptors on theregulation of renal sodium excretion. PLoS One. 2016;11:e0146641

一、模型设计原理：

GRNA介导Cas9蛋白剪切目标外显子两端的内含子DNA，同时提供同源模板Donor，基因组两端通过同源重组修复方式进行DNA修复，在特定外显子两端插入FloxP。CCKBR-FloxP小鼠与组织特异性表达Cre小鼠交配，从而实现CCKBR基因条件性敲除的目的。实验采用最新的spCas91.1进行注射，减少了基因组中的off-Target。

根据CCKBR基因组结构和蛋白功能保守区分析在Exon1的两边定点插入FloxP位点，实现将Exon1条件性敲除。

二、模型设计过程：

1) CCKBR基因GRNA靶点设计及活性检测

在要删除的Exon1外显子两端，设计gRNA靶点如下：

Cckbr-L1: GCTTAGTTGGAGCTGAGTGGG

Cckbr-L2: TGCTGGAGCTAGCTTAGTTGG

Cckbr-L3: AGCAGGTGGAACCGGTGCTGG

Cckbr-L4: CGCGGGAGCAGGTGGAACCGG

Cckbr-R1: GGACCTAGGTGGGAGCTGAGG

Reverse Complement: CCTCAGCTCCCACCTAGGTCC

Cckbr-R2: GAGGGGAGGGACCTAGGTGGG

Reverse Complement: CCCACCTAGGTCCCTCCCCTC

Cckbr-R3: TTGGAGTCAGGAGAGCTTGGG

Reverse Complement: CCCAAGCTCTCCTGACTCCAA

Cckbr-R4: TGTGAAGGTGTTGGAGTCAGG

Reverse Complement: CCTGACTCCAACACCTTCACA

使用Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒（货号：VK007）进行gRNA体外活性检测，结果如下：

gRNA靶点活性检测结果分析如下：

2）CCKBRflox/flox,villinCre小鼠设计

3）CCKBRflox/flox,villinCre小鼠模型的繁育及鉴定结果：

CCKBRfloxp/flox小鼠与Cre 的小鼠（villinCre）杂交，对后代自交获得的小鼠进行基因型鉴定，成功获得CCKBR肠道上皮细胞条件性基因敲除小鼠CCKBRflox/flox,villinCre）。见下图

经鉴定12#: CCKBRflox/flox,villinCre

CCKBRfl/fl; Villin Cre小鼠结果分析

1、生理生化指标分析：

2、肠道CCKBR检测结果：

3.小鼠有创及清醒状态血压结果：

动物模型制备过程中，由由基因工程人员设计gRNA靶点及活性检测，CCKBRflox/flox小鼠与CCKBRflox/flox,VillinCre的繁育和鉴定均由具有实验动物上岗证的专人完成，饲养人员进行日常饲喂，由兽医进行监督管理，造模期间动物状态良好，病死只数0，未使用微生物，对环境没有影响，造模方法可遗传。

胃泌素通过其 CCKBR 受体在机体内发挥作用。CCKBR 受体在机体多个器官或组织都有表达，包括肾脏、心脏、血管、消化系统等，即使在肠道，其在肠道平滑肌和肠道上皮细胞都有表达。而机体对钠吸收的部位是肠道上皮细胞，为此，我们构建小肠上皮细胞特异性CCKBR受体基因敲除小鼠（CCKBRfl/fl; VillinCre），即该小鼠小肠上皮细胞内的CCKBR受体被敲除，而体内其它器官或组织的 CCKBR 受体表达和功能正常，对于肝肾等其他组织功能无影响，更能精准模拟钠离子异常吸收导致的高血压的表型，同时更好地而模拟人类疾病及并研究相关机制和评价药效。