尾部悬吊模拟失重诱导大鼠抑郁模型

中长期飞行任务时，航天员处于持续的微重力暴露、高负荷作业、单调寂寞的狭小活动空间等复合环境中，使得航天员身心受到极大挑战，极易引起机体神经精神系统、循环系统及免疫系统等系统的生理应激反应，导致抑郁等精神行为的改变[1-3]。失重作为一种引起应激的物理刺激可引起以下生理效应：如血液头向分布、心血管系统和支持系统去载荷、重力的感受器刺激缺乏等，对由此而产生的航天飞行综合征的发生机制及对抗措施是亟待解决的航天医学难点问题[4]。

在受科学技术、经费等限制，航天飞行难以长期、重复进行，地面模拟失重的实验方法的建立就显得尤为重要。实验动物在地面模拟失重的研究中得到了广泛的应用。对于动物实验，起初是采用全身或局部限动的方法模拟失重状态下的低活动度，逐渐发展到采用头低位的方法模拟失重环境下的血液头向分布生理学效应[5]。头低位尾部悬吊模拟失重应激程度较轻，可长时间模拟失重状态。与其他应激相似，失重可引起人类及动物的下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴功能亢进，可能因此出现抑郁状态。该模型的研究可为航天特因环境下，抑郁行为机理研究、防护和药物研究提供实验基础。

参考文献：

[1] Li S, Wang C, Wang MW, et al. Impairment of the spatial learning andmemory induced by learned helplessness and chronic mild stress[J]. PharmacologyBiochemistry and Behavior, 2006, 83(2):186-193.

[2] McTeague LM, Lang PJ. The anxiety spectrum and the reflex physiologyof defense: from circumscribed fear to broad distress[J]. Depress Anxiety,2012, 29:264-281.

[3] Conrad CD. A critical review of chronic stress effects on spatiallearning and memory[J]. Progr Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiat, 2010,34:742-755.

[4] 韩兴龙,雷伟,曲丽娜,李莹辉,胡士军,殷为民.空间环境诱导心血管功能失调的细胞学机制研究进展[J].航天医学与医学工程,2019,32(05):456-462.

[5] 董丽, 王琼, 刘新民, 杨思进.地面模拟失重实验方法概况[J].中国实验动物学报, 2013, 21(05): 90-94.

1模拟失重实时监控装置的建立

装置由多个箱体单元组成，每一个箱体单元包括至少一个尾吊笼，尾吊笼设置在箱体单元内，用于提供动物尾部悬吊实验的空间；每一个箱体单元的上方安装有摄像装置，用于获取箱体单元中动物模拟失重尾部悬吊实验时的长期、动态、连续、实时的自发活动图像信息；每一个尾吊笼的上方安装有悬吊装置，用于与动物尾部连接；每一个尾吊笼上方安装有脱落检测装置，用于在动物尾部悬吊实验时，检测动物尾部悬吊是否脱落，且在检测到动物尾部脱落时，向计算机系统发出报警信号；以及计算机系统，用于接收摄像装置发送的图像信息和所述脱落检测装置发送的报警信号，并将报警信号发送给指定的实验人员。

与以往尾吊笼相比，此次的模拟失重装置具有以下特点：

（1）箱体单元包括至少一个尾吊笼，实现一个摄像装置同步对箱体单元中的至少一个尾吊笼中的动物的自主活动进行实时监控及图像提取，而且还可在摄像装置的镜头之前设置红外透镜，通过该红外透镜滤除其他光线的干扰，提高图像的信噪比。

（2）可通过脱落检测装置检测动物尾部悬吊是否脱落，通过计算机系统将报警信号发送给指定的实验人员，实现脱落报警，使得实验人员可及时进行实验干预。

（3）通过在尾吊笼外侧面设置双瓶饮水装置，可为动物的糖水偏爱实验检测提供条件，实现对抑郁或类抑郁行为的检测。

（4）箱体单元中的尾吊笼之间可设置活动隔板层，实现动物的交流受阻隔离状态和非隔离状态的互换。

总而言之，本装置的建立充分考虑到了动物模型多样本量、时间长、人工观察工作量大，脱落预处理不及时等因素，可实现对尾部悬吊的动物的自主活动的实时监测、脱落报警以及为抑郁或类抑郁行为检测提供条件。同时提供了路程、速度、时间三个指标，运动与静息两种状态的分时、分段、分区等数据，以及动物的尾部悬吊的状态等信息，能实时获取、保存和输出动物的实时活动图像，从而确保了实验的稳定性、可靠性。

图1 箱体结构图

图2 装置系统信号连接示意图

注：11：箱体单元；12：尾吊笼；13：摄像装置；14：脱落检测装置；15：食物盒；16：双瓶饮水装置；17：发光二极管；18：活动隔板层；19：栅网；20：废物收集盒；21：多路图像卡；22：实验软件；23：接口卡；24：传输接口；31：脱落检测单元；32：消息收发单元。

2模型的诱导方法

（1）动物：SPF级，Wistar大鼠、SD大鼠（200±10 g），雄性

（2）材料：医用橡皮膏、帆布手套、伤湿止痛膏

（3）仪器：动物模拟失重尾部悬吊实时监测装置(均由北京鑫海华仪公司、中国航天员科研训练中心和中国医学科学院药用植物研究所联合研制)

（4）诱导过程：大鼠尾吊采用动物模拟失重尾部悬吊实时监测装置进行，每个箱体尺寸为26㎝×26㎝×30㎝。尾吊方法简述如下：使大鼠钻入帆布手套，仅使其尾部外露。将伤湿止痛膏剪成约长7cm，宽约1cm的长条状，将其中间段1/3长度延长轴方向对叠，两头端1/3处粘在大鼠距尾根部约1cm处，使其成一个环形结构，将医用橡皮膏螺旋形包裹在其外部，避免滑脱。将一头带钩的金属链条钩住环状膏药，另一头穿过尾吊仪微动开关的环形挂圈，根据需要调节链条长度，并用金属夹将链条固定，使动物躯干与尾吊笼底部约成-30°角，使大鼠借助前肢可在尾吊笼内360°自由活动和自由饮食饮水。行为学检测期间应保持大鼠处于造模时的尾吊状态，在行为学检测时应尽量减少动物的非尾吊时间，取下后及时检测，检测完后及时恢复尾吊。

图3 模拟失重尾部悬吊实时监测装置图

1 材料

（1）试剂：大鼠皮质酮（CORT）酶联免疫分析测试盒、大鼠促肾上腺皮质激素（ACTH）酶联免疫分析测试盒（RD公司，USA），BDNF Rabbit Ab （Cell Signaling公司）

（2）仪器：

①行为学检测：大鼠空场实验实时检测系统、大鼠强迫游泳检测装置（）

② 分子生物学检测

HPA轴相关指标检测：电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）、电热温培养箱（上海科学仪器有限公司）、离心机（德国 Eppendorf公司）、全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

蛋白印迹法实验：双垂直板电泳槽、转移电泳槽、电泳仪、ChemiDoc XRS +Imager (均为美国BioRad公司)

2 评价方法

（1）行为学评价:

①空场实验

实验系统由测试箱和图像采集分析系统构成。测试箱由4个铁制的具有一定斜度的黑色圆柱形桶组成（直径80cm；高50cm），整个圆桶活动场中心内部直径为20cm的中央区，在圆柱形桶的正上方安装有摄像头，通过图像采集系统将动物自主活动状态和运动轨迹传送至计算机，软件对采集到的信息进行分析处理。参数设置结束后，将大鼠沿桶壁放入测试箱内，测试大鼠10min内的活动度，并人工记录前5min内大鼠的站立次数（两前肢离开水平面的次数）。每只大鼠测试结束后对测试桶进行清洁处理，方可进行下一次测试，测试期间保持环境安静。

②新奇事物探索实验

空场实验结束后24h，各大鼠在进行空场实验的同一测试箱内进行新奇事物探索实验。在测试箱中央处（圆心）放入一蓝色的铁制圆形柱状体（半径4cm，高10cm），将大鼠面对桶壁放入测试箱内，记录大鼠第一次接触圆柱体的时间（潜伏期）以及10min内的探索总次数，若10min内大鼠无探索行为则潜伏期记为10min。以大鼠的口鼻处离新奇物体的距离小于2cm或直接接触物体为探索行为的判断标准。

③强迫游泳试验

实验分2天进行。第1天将大鼠置于盛有自来水的玻璃缸(直径18 cm，高46 cm) 中，水深23 cm，水温25℃，游泳15 min 后取出，置于电热取暖器旁用干布将身体上水擦拭后烤干。第2天再次将大鼠放入上述同等条件水缸中，记录大鼠在5 min内的累计不动时间。

（2）分子生物学检测

①HPA轴相关指标检测

本试剂盒采用双抗体夹心法测定血清中皮质酮(CORT) /促肾上腺皮质激素(ACTH)水平。用纯化的大鼠CORT/ACTH抗体包被微孔板，向包被单抗的微孔中依次加入CORT/ACTH，再与HRP标记的CORT/ACTH抗体结合，形成抗体抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后，底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色。并在酸的作用下最终转化成黄色。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度。通过标准曲线计算血清中CORT/ACTH浓度。

② 蛋白印迹法实验

将皮层组织称重，加入预冷的蛋白裂解液（1:9），裂解液含1% PMSF，1% Cocktail和1%磷酸酶抑制剂。冰上超声破碎，充分裂解后，制备成10%组织匀浆。离心取上清，留部分检测蛋白质浓度，其余蛋白样品与5x上样缓冲液（比例为4:1）混匀，100 ℃煮5 min（煮前用封口膜封闭EP管口，以防煮沸时炸开），将煮好的样品在冰中迅速冷却，放入－20℃保存。取蛋白样品50μg，上样，以80V进行电泳，约30 min后进入分离胶，此时溴酚蓝被压成一条线；调至120V，直至嗅酚蓝染料前沿至胶底。以320 mA，2 h，转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，PVDF膜用一抗（BDNF）孵育4℃过夜。次日加二抗，室温孵育1 h，PVDF膜经SuperECL Plus超敏发光液显色，放入BIORAD凝胶成像仪检测化学发光并照相。

3 评价结果

（1）行为学结果：

①体重结果

如表所示，尾吊1周，2周，3周，4周均会导致动物体重下降，与对照组相比，有显著性差异（P<0.05）。

表1 不同造模时长模拟失重模型体重比较(单位：g)

注：与相应对照组比较，*P<0.05。

②空场实验

由下图可见，对于不同时长尾吊的动物，在自主活动检测中，对照组大鼠总路程，平均速度，运动路程，运动总时间，站立次数，中央区运动路程，中央区运动时间，中央区运动速度，中央区静息时间，周边区运动路程，周边区运动时间，周边区运动速度较模型组多（P<0.05）。而静息总时间，周边区静息时间较模型组少（P<0.05）。

图4 不同时长尾吊对动物自主活动的影响

注：（a）总路程；（b）平均速度；（c）运动路程；（d）运动时间；（e）静息总时间；（f）站立次数。与相应对照组比较，&P＜0.05。

图5 不同时长尾吊对动物中央区自主活动的影响

注：（a）中央区运动路程；（b）中央区运动时间；（c）中央区运动速度；（d）中央区静息时间。与相应对照组比较，&P＜0.05。

图6 不同时长尾吊对动物周边区自主活动的影响

注：（a）周边区运动路程；（b）周边区运动时间；（c）周边区运动速度；（d）周边区静息时间。与相应对照组比较，&P＜0.05。

③新奇事物探索实验

经过1-4周的尾吊造模后，模型组探索新奇物体的潜伏期增加，而探索次数及探索时间减少（P<0.05）

图7 不同时长尾吊对动物新奇事物探索的影响

注：（a）探索潜伏期；（b）探索次数；（c）探索时间。与相应对照组比较，^&P＜0.05

④强迫游泳试验

在强迫游泳检测中，从1周到4周的模型动物不动时间均显著性增加，攀爬次数减少，表明经历1周的造模后的动物在已出现绝望行为表现，随时间延长，这种表现并未变化（P<0.05）。

图8 不同时长尾吊对动物强迫游泳实验的影响

注：（a）不动时间；（b）攀爬次数。与相应对照组比较，^&P＜0.05。

另外，通过糖水偏爱实验检测模型动物是否出现快感缺失，并未发现模型动物与正常动物间的差异。

（2）分子生物学检测

①HPA轴相关指标检测

血清CORT和ACTH测定，与对照组皮质酮(26.44 ± 5.58) ngžL-1，促肾上腺皮质激素(49. 52 ±5. 16) ngžL-1比，尾吊14 d模拟失重模型组大鼠血清中皮质酮(47. 62 ±9.34 ) ngžL-1升高(P<0.05)，促肾上腺皮质激素(53.20 ±4.57) mgžL-1升高(P<0.01)。

②蛋白表达测定

与正常组相比，尾吊组BDNF的表达量显著减少（P＜0.01）。

图9 模拟失重对BDNF蛋白表达的影响

注：1）与空白组相比，P<0.01

本实验采用健康成年SPF级大鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入屏障实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

1 评价标准

（1） 行为学评价：

① 体重：模型动物体重显著性降低。

② 空场实验：

运动路程、运动速度、运动时间：属于水平运动指标，反映动物的活动度。模型动物运动路程、运动速度、运动时间均降低，显示活动度降低。

站立次数：属于垂直运动指标，反映了动物对新奇环境的好奇程度。模型动物站立次数减少，对新奇环境的好奇程度降低。

③ 新奇事物探索实验

潜伏期、探索次数和时间：反映动物在新奇环境中的探究能力和探索兴趣。模型动物模型组大鼠接触新奇事物的潜伏期较对照组延长同样反映动物在新奇环境中的探究能力下降，而探索次数和时间的减少表明动物对新奇事物的探索兴趣降低。

④ 强迫游泳实验

不动时间、攀爬次数：反映动物在不可逃避的环境中的绝望情绪。模型组大鼠强迫游泳不动时间较对照组延长，攀爬次数减少，在一定程度上揭示了尾吊大鼠在不可逃避的环境中产生绝望情绪。

（2）分子生物学评价：

①HPA轴相关指标检测

皮质酮、ACTH两种激素水平：皮质酮和ACTH是由HPA轴释放的激素，其水平高低反映HPA轴的功能。模型动物皮质酮、ACTH两种激素水平显著高于正常动物，显示出HPA轴的亢进。

② 蛋白表达检测结果

BDNF蛋白表达量：与神经元细胞的生长和发育及突触可塑性密切相关，是目前研究与抑郁症发生及转归关系最为密切的因子之一。模拟失重组动物BDNF蛋白表达量降低。

2 技术难点

（1)寻找适当角度并选择正确的绑尾方式，保证造模成功的同时尽可能降低对动物机体的损伤。

（2）建立无人实时监控装置，降低动物的尾吊状态未知性，以及时纠正脱落或体态改变的动物。

3 总结

1周到4周的造模时长均可选用，均可以诱导稳定的大鼠（Wistar大鼠、SD大鼠）抑郁动物模型，出于动物保护伦理的角度，推荐根据实验选用周期较短的造模时长。尾吊模型的抑郁表现为活动度降低，探索兴趣与探索能力减退，易产生绝望情绪，但并未表现出快感缺失。与其他应激方式不同，尾部悬吊针对于航天特因环境下的应激，并很好地模拟了失重效应。目前对于模拟失重所致抑郁模型鲜有报道。通过对尾吊模型的进一步深入研究，为航天特因环境致抑郁症的发生及治疗提供稳定可靠的动物模型，为我国后续中长期飞行提供技术和方法储备。