Hpd基因敲除高酪氨酸血症III型巴马小型猪

选择合适的试验动物并构建接近于人类疾病的动物模型是医学研究的基础和前提，目前试验动物的选择以哺乳动物为主，其中龋齿类动物用量最多，但与人类在组织结构、代谢特征、发病机制等方面还存在一定差距。近年来国内外越来越多的学者开始应用小型猪构建疾病模型，由于其遗传性稳定、多产、体重较小、组织器官及生化指标与人类相似[1]、在生理生化指标、解剖结构、饮食特点、药物代谢和疾病发展等方面显示出的独特优势，因此认为是用于医学研究的理想动物种类[2-3]。国外早在50年代初就开始了小型猪的研究与培育，利用世界各地小体型猪种或野猪进行多品种杂交选育而成[4]，虽然品种多，但缺乏资源优势，且遗传背景复杂、遗传性状不稳定、体形较大。80年代初中国也开始了试验用小型猪的研究，原产地小型猪种经过长期近亲体系交配和对优势品种的选择后，形成的封闭种群不仅品种资源丰富，且具有明显的地方特色，如广西巴马小型猪（如图1）、五指山小型猪、贵州小型香猪、西藏小型猪、版纳微型猪等[5]。其中巴马小型猪主要分布于广西壮族自治区巴马瑶族自治县，是原产地闭锁繁殖的优质品种，也是中国分布最广、存栏数量最大的试验用小型猪，不仅汇聚了国内各品种小型猪的大部分优点，还拥有其独特之处[6]。

由于巴马小型猪在解剖学、生理学、血液学、疾病发生过程等方面都与人极为相似，已越来越广泛地应用于医学各研究领域，如心血管系统、消化系统、皮肤整形，物质代谢、口腔学和异种器官／细胞移植等方面的研究，并积累了相关的研究背景资料。由此可见，巴马小型猪做为试验动物在医学研究中具有广阔的应用前景，使用巴马小型猪构建动物疾病模型已逐渐成为当今生物医学领域研究的热点。目前巴马小型猪作为试验动物的研究较多处于模型构建阶段，我们要学习已有的小型猪造模方法，并以动物疾病模型为基础进一步研究疾病的病因、发病机制、并发症等，探索更有效的防制措施，使医学领域的研究达到一个新的高度。

同样的巴马小型猪可以应用于遗传疾病的研究。酪氨酸血症(tyrosinemia)是一种罕见的常染色体隐性遗传代谢病，酪氨酸降解障碍导致脑、肝、肾、骨骼等多脏器损害，预后不良，致死及致残率很高。酪氨酸血症是一种代谢紊乱，机体不能分解酪氨酸。症状包括肝肾功能紊乱和认知障碍。苯丙氨酸和酪氨酸分解代谢途径中延胡索酸水解酶（FAH）、酪氨酸氨基转移酶（TAT）和4-羟基苯丙酮酸双加氧酶（HPD）的功能障碍分别导致I、II和III型酪氨酸血症。根据缺陷酶的不同，酪氨酸血症分为三型：

（1）酪氨酸血症Ⅰ型是由于FAH基因突变导致酪氨酸代谢过程的终末酶延胡索酰乙酰乙酸水解酶缺陷，酪氨酸及其代谢产物琥珀酰丙酮、4-羟基苯乳酸及4-羟基苯丙酮酸等蓄积。

（2）酪氨酸血症Ⅱ型是由于酪氨酸转氨酶缺乏所致酪氨酸分解障碍。

（3）酪氨酸血症Ⅲ型是由于4-羟基苯丙酮酸氧化酶缺乏所致疾病。血液酪氨酸水平升高和尿中4-羟基苯丙酮酸及其衍生物含量增加是遗传性酪氨酸血症III型患者的主要特征。

4-羟基苯丙酮酸氧化酶(4-OH phenylpyruvate dioxygenase,4HPPD/ HPD) 作为一种参与大多数生物体内酪氨酸分解代谢第二步所需的酶，存在于哺乳动物的肝和肾中，能够将4-羟基苯丙酮酸转化为尿黑酸（图2）[7-8]。在III型酪氨酸血症(Mckusick27671)中，该酶活性低甚至不存在，临床上主要表现为血清酪氨酸水平和尿液4-羟基苯丙酮酸、4-羟基苯乳酸、4-羟基苯乙酸水平显著升高患者通常会出现神经异常，智力迟钝和轻度共济失调，但尚未确定一致的表型[9]，目前对HPD的研究主要集中在HPD与酪氨酸血症等疾病的关系上，而对其转录调控的报道较少，并且对HPD在肝脏中特异性表达的转录调控机制尚不清楚，也未见报道。

目前为止，已有报导发现小鼠Hpd等位基因纯合突变阻断酪氨酸分解代谢。小鼠肝脏HPD活性降低导致III型酪氨酸血症，其特征表现为常染色体隐性遗传性疾病，血液中酪氨酸水平升高，大量酪氨酸衍生物排泄到尿中。伴有Hpd纯合错义突变和Hpd缺乏的酪氨酸血症III型患者存在神经异常，但HPD表达调控的机制尚不清楚。在已有的报告中，已证明了分子伴侣四肽重复结构域36（TTC36）与HPD结合并阻断丝氨酸/苏氨酸激酶33（STK33）介导的HPD的T382磷酸化，从而阻止含有PELI1的FHA结构域与HPD的结合以及随后的HPD多泛素化和降解。小鼠Ttc36基因敲除可降低HPD在肝脏的表达，导致酪氨酸血症表型，并伴有神经病变和学习记忆障碍。

在前期研究HPD基因的基础上，我们利用CRISPR/Cas9技术成功敲除4-羟基苯丙酮酸氧化酶制备高酪氨酸血症Ⅲ型巴马小型猪模型。从而为深入了解4-羟基苯丙酮酸氧化酶在遗传性酪氨酸血症中的作用，也为更好地研究和治疗酪氨酸代谢相关疾病奠定基础。

3.1 实验材料 3.1.1 实验动物

动物品系：巴马小型猪；

等级：普通级；

动物规格：代孕母猪，5头，24月龄，体重40kg；供卵母猪，20头，12月龄，体重30-35kg；

出售单位：南方医科大学实验动物中心；

实验单位：南方医科大学实验动物中心；

合格证编号：44410500000270

实验单位使用许可证编号：SYXK（粤）2016-0167；

许可证号：SCXK（粤）2016-0041。

本研究所用的巴马小型猪均在南方医科大学实验动物中心饲养。所有动物实验都经南方医科大学实验动物福利与伦理委员会（IACUC）批准。实验动物饲养和实验过程均按照实验动物使用的3R原则给予人道的关怀，所有手术均在麻醉下进行，并尽可能减少动物的痛苦。

3.1.2 实验耗材 3.1.2.1 主要试剂耗材

1、BsaI（NEB）

2、AgeI（NEB）

3、T4 DNA连接酶（Takara）

4、胶回收试剂盒（Takara）

5、pMD19-T Vector Cloning Kit（Takara）

6、质粒小提试剂盒 （Takara）

7、基因组DNA提取试剂盒（Takara）

8、pST1374-NLS-flag-linker-Cas9 （Addgene）

9、pGL3-U6-gRNA-PGK-puromycin （Addgene）

10、RNA抽提试剂（酚:氯仿:异戊醇=25:24:1，pH<5.0）（索莱宝）

11、DNA抽提试剂（酚:氯仿:异戊醇=25:24:1，pH>7.8）（索莱宝）

12、Premix Taq（Takara）

13、矿物油（胚胎级）：Sigma

14、甲醇（天津市大茂）

15、四烯雌酮（北京市科益丰生物技术发展有限公司）

16、前列腺素F2α（宁波三生）

17、D-PBS（索莱宝）

18、BSA (Sigma)

19、sgRNA体外转录试剂MEGAshortscript（Ambion）

20、Cas9体外转录试剂mMESSAGE mMACHINE® T7 Ultra Kit（Ambion）

21、X5 高保真DNA 聚合酶 (MF003)（聚合美生物科技有限公司）

22、青霉素钾（成都中牧生物药业有限公司）

23、硫酸链霉素（华北制药集团动物保健品有限责任公司）

24、手术切口无菌膜（海壳生）

25、可吸收缝线（金环）

26、常用手术器械（金钟）

27、毛细玻璃管（北京正天易科贸有限公司）

28、不同规格的培养皿、离心管、EP管、吸头等（Corning）

3.1.2.2 设备耗材

1、高速冷冻离心机（Eppendolf）

2、高速离心机（Eppendolf）

3、生化培养箱（上海福玛实验设备有限公司）

4、紫外分光光度计（Nanodrop）

5、电泳仪(Bio-rad)

6、电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）

7、超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）

8、生物安全柜（HFsafe-1800）

9、毛细管注射针（Sutter）

10、金属浴（杭州朗基科学仪器有限公司）

11、凝胶成像系统（Bio-rad）

12、PCR扩增仪（Bio-rad）

13、超低温冰箱（SANYO）

14、恒温热台(TOKAT HIT)

15、显微注射显微镜(OLYMPUS)

16、显微操作系统 （TransferMan NK2，Eppendorf）

17、体视显微镜（Nikon）

18、拉针仪（SUTTER）

19、磨针仪、煅针仪（Narishige）

20、胚胎移植管（北京比威克生物公司）

3.1.3 试剂配制

表1 PZM-3培养液配制

Table 1 PZM-3 culture solutionpreparation

表2 TCM-199操作液配制

Table 2 TCM-199 operating fluid preparation

取20ml母液加入0.06gBSA，调pH值至7.2-7.4，即为工作液。

充分溶解上述物质，高压蒸汽灭菌后加入2 g BSA以及5 ml青/链霉素，上下颠倒混匀。-20 ℃保存备用。

3.2实验方法

3.2.1 Cas9质粒线性化与纯化

采用AgeⅠ核酸内切酶线性化Cas9质粒pST1374-NLS-flag-linker-Cas9（Addgene ID：44758），体系如下（表4）：

冰上混匀上述体系，37 ℃孵育3 h。

3.2.2 Cas9体外转录

采用mMESSAGE mMACHINE® T7 Ultra Kit试剂盒进行Cas9 mRNA体外转录，具体操作为：

（1）Cas9体外转录，体系如下：

冰上混合上述体系，37 ℃孵育1 h。加入1 ul TURBO DNase 37 ℃孵育15 min去模板。

（2）Cas9 mRNA加尾，体系如下：

冰上混匀上述体系，37 ℃孵育45 min。

（3）Cas9 mRNA纯化

将上述反应产物转移到一新的RNase-free 1.5 ml EP管中，加入400 ul RNase-free ddH2O，将体积调整为500 ul，采用苯酚-氯仿-异丙醇法纯化。纯化完成后进行1 %琼脂糖-甲醛变性胶电泳检测Cas9 mRNA质量，并将sgRNA的最终将浓度调整为1000 ng/ ul，-80 ℃保存备用，避免反复冻融。

3.2.3 SgRNA-Hpd获取

（1）pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin酶切

以pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin（Addgene ID：51133）质粒作为sgRNA的骨架载体，采用Bsa Ⅰ限制性内切酶酶切载体，体系如下：

37℃孵育2 h，65℃孵育20 min灭活酶。酶切结束后，以1%琼脂糖凝胶电泳，在切胶仪中切下酶切载体，胶回收操作进行酶切载体的胶回收。

（2）SgRNA设计

通过GeneBank网站 查找猪Hpd 基因组序列。利用CRISPR 设计网页于猪Hpd基因第6 号外显子上(E6)设计20 bp 的靶向序列，并合成两条互补的单链 oligos。

（3）载体构建

退火形成双链后连接到pGL3-U6-gRNA-PGK-puromycin 载体的Bsa I位点。以上述产物为模板通过X5高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，完成sgRNA体外转录所需的模板制备。sgRNA-Hpd 正向引物：

5 ’TTAAT ACGACTCACTATAGAGTGAAGGACATTGCGTTCG- 3’；sgRNA-Hpd 反向引物； 5 ’-AAAAGCACCGAC TCGGTGCC-3’。sgRNA 模板获取PCR 反应条件：98℃ ，5 min，98℃ ，30 s ；60℃ ，30 s ，72℃ ，30 s，37 个循环，72℃ ，10 min，4℃ 保存。应用 MEGAshortscript TM Kit试剂盒对上述体外转录模板进行体外转录获得sgRNA-Hpd。

3.2.4 巴马小型猪同步发情与受精卵获取

A、动物和动物护理

1、在特定的无病原体农场饲养所有动物。以限制性饮食（4%体重）喂养动物，并自由饮水。

2、正常饲养，但要特别小心，尤其是在分娩期间。

3、所有的动物均按照实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

B、同步发情

供卵母猪和代孕母猪均拌料饲喂给药四烯雌酮20 mg / d，连续饲喂18d诱导同步发情。停药后，每天上午和下午均在猪采食30 min后，通过压背法和外阴观察法检测母猪的发情状态，母猪在停止喂服四烯雌酮后第5天左右开始有发情迹象，阴道变红变肿。这时每天用公猪试情1-2次，诱导母猪发情更加同步。通过阴道细胞涂片结晶紫染色法来判断母猪是否已达到最佳发情状态。首先将棉签轻轻地插入母猪阴道并旋转数圈。抽出棉签，将阴道物均匀涂布在载玻片上，并自然晾干（棉签在玻片上应朝一个方向滚动涂布，不可重复涂布，避免细胞重叠影响观察）。然后载玻片用甲醇脱水30 s，并自然晾干。接着结晶紫溶液染色1 min。最后用清水冲洗3次，并再次晾干，显微镜下观察。在普通光学显微镜下观察涂片上的表皮细胞的大小、形态及比例等来判断西藏小型猪的发情阶段。当镜下观察到大部分细胞为边缘皱褶、体积较大且无细胞核的完全角质化鳞状上皮细胞时，母猪处于最佳发情状态，即可进行自然交配。

C、 取卵

供卵母猪在配种后16-18 h要进行取卵手术，收集单细胞期受精卵。具体步骤如下：（1）术前母猪禁食12 h；（2）速眠新联合异氟烷麻醉；（3）下腹部剃毛备皮、清洗、手术消毒；（4）在下腹鼠蹊部肌间隙处开出4-6 cm手术切口；（5）将食指和中指从术口探入腹腔内，凭手指触觉分辨出子宫角（相对于肠而言，子宫角壁较厚一些），用双指轻轻将其夹出，将卵巢和输卵管暴露在手术视野中；（6）将无菌塑料导管的一端从输卵管伞部天然开口处插入，另一端置至塑料平皿上；（7）在输卵管子宫角交接处靠近输卵端轻轻插入一根留置针。同时用手捏紧靠近子宫角的输卵管，防止冲卵时液体进入子宫；（8）用注射器将含0.1%牛血清白蛋白的杜氏磷酸盐缓冲溶液从留置针处推入，液体和胚胎经输卵管从伞部开口沿塑料导管被冲入塑料平皿中；（9）在视显微镜下用口吸管捡卵，将卵移至操作液滴中。如图3。

3.2.5 显微注射

（1）注射液滴准备

吸取35 ul左右操作液，于6 cm细胞培养皿皿盖上做一长条形液滴，并用矿物油覆盖，放于38.5℃热台上保温。

（2）毛细玻璃管RAMP TEST 坡度测试。

在拉制注射针或持卵针前，需要先对每种毛细玻璃管进行RAMP TEST坡度测试，以测试参考HEAT参数。具体操作如下：

①将毛细玻璃管安装到拉针仪P-97上；

②打开开关，按0 ~ 9任意键，Enter，进入下一步程序；

③按<CLR>清除键进入控制功能；

④按<0>不要清除参数设置值；

⑤按<1>，<Pull>运行RAMP TEST坡度测试；

⑥运行RAMP TEST时可以观察到HEAT值持续增加，待增加到某一数值时，加热关闭，HEAT值也不再增加，记录此时的HEAT值，即为测试结果；

⑦按<RESET>返回主界面。

（3）持卵针拉制

①将毛细玻璃管安装到拉针仪上；

②按<1>进入程序1，根据坡度测试结果设置如下参数：

HEAT：702 PULL：70 Vel：80 Time：70

③按<Pull>，开始拉制；

④拉制结束后，小心取下玻璃管，安装到断针仪上；

⑤在低倍镜下调节玻璃加热球至最清晰位置；

⑥使持卵针处于水平位置，在高倍镜下将持卵针针尖十小格处紧贴加热球，调节加热旋钮至60处，迅速踩下加热脚踏并立即松开，此时针尖断裂；

⑦使持卵针保持竖直状态，针尖缓慢接近但不得贴上加热球，踩下加热脚踏，缓慢加热至针尖内壁卷曲至合适大小；

⑧在合适位置烧弯针尖至30度角。

（4）注射针的拉制

①将毛细玻璃管安装到拉针仪上；

②按<2>进入程序2，根据坡度测试结果设置如下参数：

HEAT：726 PULL：60 Vel：70 Time：100

③按<Pull>，开始拉制；

④拉制结束后，小心取下玻璃管，安装到断针仪上；

⑤在低倍镜下调节玻璃加热球至最清晰位置；

⑥将注射针竖直安装到断针仪上，使针尖中部靠近（不得贴上）玻璃加热球；

⑦踩下加热脚踏，逐渐增加加热温度，使针尖弯曲至30。角。

（5）配制Cas9 mRNA与sgRNA溶液

于Nuclease-freePCR管中配制注射液，体系如下（表8）；

用Nuclease-freetip配制上述体系，4℃，3000 g离心2 min，取10 ml上清转移到新的PCR管中。

（6）持卵针、注射针安装

将受精卵移入注射液滴，在显微操作平台上调节焦距至受精卵清晰状态。将矿物油注射入拉制好的持卵针内，尽量排除气泡。将持卵针安装到操作臂上。粗调操作臂，待持卵针尖刚好与矿物油界面接触时改为微调，并在低倍镜下找到持卵针阴影。于油中微调持卵针至针尖清晰为止。

将注射针粗端插入配制好的注射液中，利用虹吸作用自动上样。待注射液液面处于合适位置时，拿出注射针安装于操作臂上，具体调节方法同持卵针。

（7）显微注射

将注射针与持卵针移入油中，注射针在持卵针表面摩擦的同时给予一定压力，直到有速度适宜的注射液滴流出为止。用持卵针固定受精卵，注射针从卵的3点钟方向插入卵胞质中，此时会在高倍镜下明显观察到卵胞质的流动以及受精卵膨胀。拔出注射针，吹掉受精卵，进行下一个受精卵的注射（图4）。注射完毕，将受精卵移回培养液滴中，于38.5℃，5% C2O，饱和湿度条件下培养 30 ~ 60 min，挑选状态良好的受精卵行胚胎移植。

3.2.6 胚胎移植

1、在微量注射CRISPR/Cas9质粒载体后，用移液管将10～15个胚胎移植到代孕猪输卵管内，手术方法为：

a、术前禁食12小时，自由饮水。

b、术前20分钟分别注射硫酸阿托品和速眠新，以减少唾液分泌和镇静动物。

c、异氟烷维持麻醉，手术时间40～50min。

d、将代孕母猪仰卧保定在手术台上。清洁腹部皮肤、备皮、消毒、铺巾。

e、在下腹鼠蹊部开一小口，将输卵管和卵巢的单侧拉出腹外，以便胚胎移植。

f、将10-15个胚胎吸至胚胎移植管，吸入的液体和空气尽可能少。将胚胎移植管轻轻从输卵管伞部开口插入，进至输卵管第一个大弯曲之后。将移植管内含胚胎的液体注入输卵管，并把移植管退出。

g、用含硫酸肝素（50000 U/L）的生理盐水冲洗子宫角，然后放回腹腔。

h、胚胎移植后，连续缝合腹膜壁和腹壁肌肉，间断垂直褥垫缝合脂肪层和皮肤。

i、术后连续3天肌肉注射青霉素和链霉素预防感染。

j、移植后19~21 d，用猪早孕检测试纸检测是否妊娠，妊娠过程中留意代孕母猪有无返情。如图5。

3.2.7 产仔和小猪护理

1、将母猪在预期分娩日前七天转移到产栏。

2、观察母猪紧张不安的行为，进一步用手挤奶检查泌乳情况。

3、在母猪开始泌乳的当天，对母猪进行严格的检查，确定其中任何一头母猪需要帮助分娩，并照顾好新生儿。

4、第二天产仔结束后，收集仔猪尾部组织样本进行DNA提取和进一步的基因组分析。

3.2.8 基因型鉴定

每头F0代巴马小型猪分别进行耳号标记并剪取少量耳组织，用基因组提取试剂盒TIANamp Genomic DNA kit 提取基因DNA。设计相应PCR引物扩增巴马小型猪HPD基因6号外显子（表9），TAQ酶进行PCR扩增目的片段。并将PCR产物用pMD19-T Vector Cloning Kit进行TA克隆。最后挑取10个单克隆,测序分析。

3.2.9 蛋白表达水平检测

蛋白表达水平检测按照标准操作提取#3和#4巴马小型猪肝组织全蛋白并进行浓度测定，取20 μg进行蛋白电泳。SDS-PAGE分离胶和浓缩胶分别按照浓度为10%和5%配置，电压为恒压80 V，30 min；120 V，60 min。电泳结束后切下目的蛋白与内参条带，转膜：恒定电流200 mA，120 min。5% BSA 溶液封闭1 h。一抗4℃孵育过夜( Anti-HPD antibody，ab232906)，TBST洗膜10 min×3 次，二抗室温孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，化学发光仪显影。

3.2.10 血液氨基酸检测

（1）样品采集：仔猪出生15 d后，将新鲜外周血采集后滴于专用采血滤纸上，自然晾干3 h，待完全干燥后放于封口塑料袋内，置于-20℃冰箱中保存待检。

（2）样品处理方法：本研究用血液氨基酸检测仪器为美国生物应用系统公司(Applied Biosystems) 3200QTRAP 型串联质谱仪。将干燥血液滤纸片用打孔器制成直径为3 mm的圆形滤纸血片后置于96孔聚丙烯板中(高低各1各质控)。同时，向每孔加入甲醇溶液100 μL(含有同位素内标)，用Teflon 膜覆盖，置于45℃环境密封震荡45 min，设置振荡频率为650 r/ min。震荡完毕后室温放置20 min，转移其中75 μL至新的96孔聚丙烯板并用铝膜覆盖，随后即可上样检测[11]。

（3）数据分析：定量分析采用美国生物应用系统公司软件ChemoView1，2(Applied Biosystems)，根据同位素内标及其相对应的离子峰强度，根据浓度已知的内标，即可自动计算出样品中所含氨基酸的浓度。

3.2.11 尿液酪氨酸代谢产物检测

（1）尿样采集和预处理:通过仔猪代谢笼收集猪尿样10 mL于15 mL离心管中，迅速置于-20℃冰箱保存待检测。尿液样本经3500 r/ min离心10 min以去除杂质和蛋白质，并取上清测定尿肌酐值。

（2）样品处理方法：将预处理样品根据所测定肌酐值取0. 2 mg肌酐量的尿液加入1 U/ μL尿素酶共20 μL，置于37℃反应30 min后取出加入内标液和纯水补足终体积为2 mL。然后依次加入5%盐酸羟胺500 μL和2. 5 mol / L氢氧化钠溶液 400 μL 混匀后于室温静置1 h。待反应完成后加入6 mol / L盐酸350 μL终止反应并加入乙酸乙酯6 mL混匀，3500 r/ min离心5 min取有机相至另一试管中并重复一次。加入无水硫酸钠离心吸取上清液，于60℃恒温用氮气吹干样本。向样品中加入BSTFA+10% TMCS硅烷化试剂100 μL，置于80℃恒温箱中30 min，衍生完成后待样品冷却即可取样检测。

（3）色谱及质谱条件：本研究所用气相色谱-质谱联用仪为日本岛津 GCMS-QP2010 ultra分析仪。色谱柱DB25(30 m × 0. 25 mm × 0. 25 μm)；进样口 温度280℃ ；柱温100℃持续4 min，以4℃ / min的速率升温至280℃，保持10 min，再以10℃ / min升温至300℃保持10 min；载气：高纯氦气(99. 999%)；体流 速：43. 0 cm / s，分流比20：1；接口温度280℃ ；离子源温度：200℃ ；质谱扫面范围：50 ~ 500 amu，数据分析软件为GCMS Solution 4. 11。

3.3 结果 3.3.1 sgRNA 设计及Cas9 mRNA和sgRNA制备

sgRNA-Hpd设计位点如图6所示。体外转录后经RNA电泳显示其中 sgRNA-Hpd 片段大小为120 bp左右（图7），Cas9 mRNA片段大小为4300 bp左右。表明成功制备了Cas9 mRNA和sgRNA-Hpd。

A.Cas9质粒酶切；B.Cas9 mRNA体外转录。

3.3.2 受精卵胞质内共注射Cas9mRNA和sgRNA建立HPD基因修饰巴马小型猪

将20枚巴马小型猪的单细胞期受精卵予以胞质内显微共注射Cas9 mRNA 和sgRNA-Hpd(图8)。移植至2只代孕母猪。2只代孕母猪怀孕，共出生2窝，获得F0代巴马小型猪共4只，公母比例为2 ∶2 (表10)。

3.3.3 基因型鉴定

TA克隆的测序结果如表11所示。测序结果显示4头F0代中1只为野生型，Hpd 基因未发现有突变，与野生型巴马小型猪的Hpd 基因序列完全一致。其余 3头F0代巴马小型猪在sgRNA-Hpd所介导定位的Hpd 基因位点上出现了随机删除或插入若干个碱基(表11)。结果表明，F0代巴马小型猪Hpd基因突变位点具有长度可变或碱基对替换数目可变的特点。这些DNA序列的变化通常导致编码区域的截断或编码框架移位，从而导致Hpd基因功能障碍。

3.3.4 HPD蛋白表达

Westernblot检测结果如图9所示，未发生Hpd基因敲除的巴马小型猪( #4)与野生型巴马小型猪相比，肝组织HPD蛋白表达量未发生任何改变；相反，#3巴马小型猪由于Hpd基因敲除后，肝组织HPD蛋白则完全没有表达。

图 9 HPD 蛋白表达水平

Figure9 The relative expression of HPDprotein

3.3.5 血液酪氨酸水平

血液酪氨酸检测结果显示，和野生巴马小型猪血液酪氨酸水平相比，#1，#2，#3巴马小型猪发生Hpd基因敲除后血液酪氨酸水平明显上升，均达到1200 μmol / L 以上；相反，由于酪氨酸水平上升，苯丙氨酸处于正常水平，苯丙氨酸和酪氨酸比值(Phe / Tyr)在发生Hpd基因敲除巴马小型猪( #1, #2,#3)中显著降低（图10）。

3.3.6 尿液氨基酸代谢产物含量

显著升高的尿液4-羟基苯乳酸和4-羟基苯乙酸水平是高酪氨酸血症III型的重要临床特征。通过基因型鉴定我们已确认#1和#2巴马小型猪模型成功敲除 Hpd基因，通过气相色谱-质谱分析检测尿液酪氨酸代谢产物水平结果显示，与野生型巴马小型猪相比，#1和#2巴马小型猪尿液4-羟基苯乳酸和4-羟基苯乙酸水平明显上升（图11）。

3.3.7 脱靶检测结果

所有潜在的脱靶位点PCR扩增后进行Sanger测序并于野生型基因组比对。结果显示所有检测的脱靶位点均无突变发生（图12）。

评价指标体系：

表1评价指标

Table 1Evaluation indicators

高酪氨酸血症III型西藏小型猪模型通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除HPD基因而获得的，没有插入任何外源基因，为非转基因动物。获得的该西藏小型猪模型由于是通过受精卵胞质注射法而制备的，不携带异种品系猪的线粒体DNA——母系遗传物质，能保持品系的纯正。所用的受精卵均通过手术体内冲卵获得，没有到屠宰场采集卵巢和卵母细胞，生物安全可控。HPD突变引起的疾病为隐性性状，可通过纯合子之间交配繁殖保种，得到的后代均为高酪氨酸血症III型西藏小型猪模型，能稳定遗传。该模型能在普通实验饲养环境能正常繁殖存活，生物安全性高。

血液酪氨酸水平的升高和尿液4-羟苯丙酮酸及其衍生物的增加常被认为是遗传性酪氨酸血症的显著特征。本研究利用CRISPR/ Cas9技术靶向编辑巴马小型猪Hpd基因成功制备了高酪氨酸血症III型巴马小型猪模型。通过基因型鉴定确认了其中3只巴马小型猪的Hpd基因发生敲除，1只未发生敲除，整体敲除效率达到75%。为检测是否存在脱靶效应，我们将外显子序列中与sgRNA-Hpd 匹配达到15bp以上基因序列作为潜在可能的脱靶位点。经PCR扩增后送样进行 Sanger测序，所有检测的潜在脱靶位点均未发生突变，所以我们猜想，#4巴马小型猪未发生突变可能的原因是因为显微注射未成功或是sgRNA-Hpd未成功打靶。为进一步确认其表型，我们通过Western blot结果发现，敲除Hpd基因后巴马小型猪肝组织HPD蛋白完全不表达，通过检测巴马小型猪的血液氨基酸浓度，发现Hpd基因敲除的3只巴马小型猪酪氨酸浓度显著升高；进一步我们通过气相色谱检测尿液酪氨酸代谢产物发现Hpd基因敲除巴马小型猪的尿液4-羟基苯乳酸和4-羟基苯乙酸水平显著上升，这与人类III型酪氨酸血症的临床特征一致( Endo等人1983)[12]。而仅仅是 HPD 酶活性缺乏似乎不会引起肝肾功能异常[13]。

可以预料，随着串联质谱法的使用越来越多，以及在新生儿筛查项目中纳入酪氨酸测量，持续高酪氨酸水平的无症状婴儿数量将越来越多。根据本文提供的数据，巴马小型猪高酪氨酸血症III型模型可作为人类III型酪氨酸血症的理想的模型。这一新的基因敲除巴马小型猪遗传性酪氨酸血症可以用来深入了解4-羟基苯丙酮酸氧化酶在遗传性酪氨酸血症中的作用，为更好治疗酪氨酸代谢相关疾病奠定基础。