人类冠状病毒229E（HCoV-229E）感染小鼠肺炎模型

1. 研究意义

近年来，新发冠状病毒性疾病的不断出现（如SARS、MERS、COVID-19）迫使人类寻找有效的应对策略，从多方面建立控制突发疫情的手段及方法迫在眉睫。抗病毒疫苗和特异性新药的研发受制于对病原的基础研究以及病毒的不断变异，因而困难多、周期长，在突发疫情时难以发挥快速作用，而从现有上市药物或临床试验中筛选有效药物是一行之有效的快捷手段。

高致病性感染动物模型的建立依赖于病原来源、致病机制、临床表现以及检测手段等条件，尤其需要P3或P4级试验条件，因此，特异性针对每个新发病毒的动物模型需要长期的研究，严重限制了在紧急疫情时寻找有效药物以及日常相关研究。因此，除建立特定高致病性病毒感染动物模型之外，建立相关低致病性冠状病毒感染动物模型更加实用和重要，不仅在应对重大疫情快进行速药物筛选及评价有积极作用，同时解决了突发疫情或日常研究中P3及P4生物安全试验条件的限制，更有利于推广应用。

2. 研究目的

采用感染性较弱的冠状病毒229E株建立小鼠肺炎模型，使其达到客观化、科学化、标准化、规范化，为紧急疫情时初步应急筛选有效的药物提供手段；为相关冠状病毒感染日常科研工作或新药研发提供手段。

3. 国内外研究进展

目前国内外已经有报道成功构建的冠状病毒感染的动物模型包括：MERS-CoV感染转基因小鼠模型[8]，MERS-CoV感染人原化小鼠模型[9]，MERS-CoV感染恒河猴模型[10-12]，MERS-CoV感染狨猴模型[13]，MERS-CoV感染单峰驼模型[14]；SARS-CoV感染食蟹猴、恒河猴、非洲绿猴、狨猴模型[15-19]，SARS-CoV感染小鼠模型[20-22]，SARS-CoV感染仓鼠模型[23]，SARS-CoV感染猫科动物模型[24-25]，SARS-CoV感染雪貂模型[24]。但由于上述病毒的高致病性，对试验条件及试验室安全性要求高，以及动物来源有限、成本高等多方面的原因并不适合做抗冠状病毒药物的筛选模型以及日常科研。国外仅有1篇简单报道有关HCoV-229E感染裸小鼠的实验文章，而其他冠状病毒感染的动物模型并未有报道。

4．创新性

首次建立了HCoV-229E感染Balb/c小鼠肺炎模型，并形成规范的评价标准，国内外未见报道。

5．模型优势

试验操作在P2试验室条件下进行。动物来源充足、成本低、易操作、易于运输、易于推广。动物及相关试验废弃物容易处理

6．应用范围

治疗呼吸道病毒性疾病中药筛选及药效评价中药治疗冠状病毒感染的机制研究与人类冠状病毒感染相关药物的筛选及评价与229E（HCoV-229E）感染相关的基础研究。

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1试验材料

1.1试验动物

1.2病毒株 ：人类冠状病毒229E（HcoV-229E ），来自中国医学科学院医药生物技术研究所， 由本试 室传代、增殖、测滴度后负 80 ℃冰箱保存。 1.3 试验试剂

1.4 试验仪器

1.5试验用药

1.6试验环境：中国中医科学院中药研究所ABSL-2室内进行。试验间恒温恒湿，温度控制在（24±2）℃，日温差：≤4°C；湿度控制在40%~70%，试验室压力为-20Pa。

2试验操作规程

2.1病毒传代

取已长成单层A549、MDCK细胞的25cm2培养瓶，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，加入HCoV-229E的病毒液200μl，置37℃5％CO2培养箱中培，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，72~96h，直至80％细胞出现明显病变（CPE）后，将细胞培养瓶置于-80℃低温冰箱冻存，病毒液反复冻融3次后，用于检测病毒毒力。

2.2病毒滴度测定

取已长成单层A549、MDCK细胞的培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，按10倍稀释接种不同滴度的HCoV-229E病毒液，10-1~10-8共8个稀释度，100l/孔，每个浓度4个复孔，同时设正常细胞对照。置37℃5％CO2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，72h~96h记录各孔的细胞病变情况。

细胞病变按6 级标准判断：

－：细胞生长正常，无病变出现；

±：细胞病变少于整个单层的10％；

+：细胞病变约占整个单层细胞的 25 ％以下

++：细胞病变约占整个单层细胞的 50 ％以下

+++：细胞病变约占整个单层细胞的 75 ％以下

++++：细胞病变约占整个单层细胞的 75 ％以上。

按ReedMuench 计算 50% 细胞病变浓度（TCID 50），经计算 HCoV 229E病毒的TCID 50为10 -2 。

2.3 动物模型的制备

表1结果显示：

采用MDCK培养病毒液10TCID50、100TCID50两个浓度，感染ICR、Balb/c及Balb/c-nude小鼠后，肺指数、肺组织中病毒核酸表达均没达到模型建立标准。

采用A549培养病毒液10TCID50浓度，感染ICR、Balb/c及Balb/c-nude小鼠后，肺指数、肺组织中病毒核酸表达均没达到模型建立标准。

采用A549培养病毒液在100TCID50浓度，感染ICR小鼠，肺指数、肺组织中病毒核酸表达都没达到模型建立标准；感染Balb/c-nude，肺指数、肺组织中病毒核酸表达有一定变化趋势，但没达到模型建立标准。

采用A549培养病毒液在100TCID50浓度，1次感染Balb/c，3天后肺指数明显增高、肺组织中病毒核酸呈高表达，达到模型建立标准。但5天后有明显降低，提示模型呈恢复趋势。在此基础上，采用2次感染后，肺指数明显增高、肺组织中核酸高表达，并可稳定维持至感染后5天，达到模型建立标准。

试验期间无动物死亡发生。因此，形成以下模型制备方法：

取Balb/c小鼠20只，SPF级，体重14±1g，雌雄各半，按体重等级随机分为正常对照组、HCoV-229E模型组，每组10只。HCoV-229E模型组小鼠分别于第1天、第3天用乙醚轻度麻醉后，以100TCID50的HCOV-229E病毒液滴鼻感染，50μL/只。正常对照组在同等条件下滴鼻生理盐水。感染第5天进行相关指标检测。小鼠肺部CT；称重；眼眶取血，滴至生理盐水中备测淋巴细胞分型比例；解剖取肺脏称重，计算肺指数及抑制率；取部分肺组织-80℃留存备用，检测病毒载量和炎性细胞因子；取心、肝、脾、肺、肾、胃、肠，置于4%多聚甲醛固定，备用组织病理学检查。

3 动物模型考察指标结果及评估

3.1 肺部炎症

表2结果显示：采用HCoV-229E感染小鼠后，小鼠肺指数明显增高，与正常对照组比较有显著性差异（P<0.01）；2个受试药物在所试剂量内对HCoV-229E感染后小鼠肺指数有显著的降低作用，与模型对照组比较有统计学差异（P<0.01）。

3.2肺组织核酸表达

表3 结果显示：正常对照组动物肺组织中无 HCoV-229E核酸表达； 采用 HcoV-229E感染小鼠后，小鼠肺组织中有明显核酸表达；给药方剂 1-2 、连花清瘟可明显降低肺组织中病毒核酸表达量。3.3 肺组织中炎性因子

表4结果显示：采用HcoV-229E感染小鼠后，小鼠肺组织炎性因子IL-6、IL-10及TNF-a均明显增高，与正常对照组比较有显著性差异（P<0.01）；2个受试药物给药4天后对肺组织中IL-6、IL-10及TNF-a含量均有明显降低作用，与模型对照组比较有显著性差异（P<0.01）。

3.4外周血免疫细胞比例

表5结果显示：采用HCoV-229E感染小鼠后，小鼠外周血中免疫细胞CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞及B细胞的百分比均明显降低，与正常对照组比较有显著性差异（P<0.05、P<0.01）；2个受试药物给药4天后对以上免疫细胞有不同程度影响，处方1-2小剂量组可升高B细胞的百分比；连花清瘟提取物小剂量组可升高CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞及B细胞的百分比，与模型对照组比较有显著性差异（P<0.05、P<0.01）。

3.5肺组织病理：见附件1

3.6肺部CT

一、动物模型评价方法：

1. 取肺称重，计算肺指数及抑制率

2. 肺组织中核酸检测（RT-PCR法） 核酸裂解处理： 小鼠解剖后将肺组织分装置于-80℃低温冰箱中保存；将小鼠肺组织从-80℃低温冰箱中取出，置于洁净的研钵中，倒入少量液氮并使用研杵将其研磨成粉末，收集粉末于1.5ml离心管中并立即加入1ml TRIzol Reagent，轻弹管底，尽快混合样品至重悬；室温水平放置离心管，孵育20min；4℃，12000rpm，离心10min；将澄清上清液移入新的1.5ml离心管中；加入0.2ml氯仿，盖紧管盖，用力摇动离心管15s，室温孵育2-3min至液体分层；4℃，12000rpm，离心15min；h）将透明上清液小心移入新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min；4℃，12000rpm，离心10min；j）弃去上清，用1ml75%乙醇轻洗沉淀（使白色沉淀轻轻飘起）；4℃，7500rpm，离心5min；吸尽上清液，短暂干燥RNA沉淀5-10min；m）用20μl DEPC水溶解沉淀，﹣80℃低温冰箱保存。 核酸测定： 对照品核酸处理：DEPC-H2O作为阴性对照。阳性对照品进行10、100、1000倍梯度稀释。 试剂配制：取n×18µl HCoV-229E核酸荧光PCR检测混合液，n×1µl内部对照品，与n×1µl RT-PCR酶（n为反应管数），振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。 加样：取上述混合液20µl置于PCR管中，然后将样品核酸提取液、DEPC-H2O、阳性对照品各5µl分别加入PCR管中，改进管盖，离心数秒使所有液体置于底部，立即进行PCR扩增反应。 PCR扩增：反应管煮鱼定量荧光PCR仪上，循环参数设置为：45℃×10min；95℃×15min；再按95℃×15sec→60℃×60sec，循环40次；单点荧光检测在60℃，反应体系为25µl。 荧光通道检测选择：选用FAM和HEX/VIC/JOE通道。 备注：使用ABI系列PCR仪，请务必于passive reference和quencher处均选择“none”。 统计方法及实验结果： 计算方法：3. 小鼠肺组织中炎性因子检测（Elisa 法） 样品收集及储存： 组织匀浆液样本：小鼠取肺组织称重后，收集每组3、4、5、6、7、8号小鼠肺组织，-4℃保存。称量50mg肺组织加入500μL生理盐水后，使用超声细胞破碎仪匀浆组织，使用低温高速离心机-4℃ 1000 x g 离心10分钟。吸取上清液之后分装，保存于-80℃冰箱贮存备用。避免反复冻融。 样本准备工作：样本用稀释剂2倍稀释后进行检测，即50 μL 血清 + 50 μL 稀释剂。 从已平衡至室温的密封袋中取出微孔板，分别将不同浓度标准品，实验样本或者质控品加入相应孔中，每孔 100 μL。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育 2 小时。用洗液洗板，重复操作 4 次。最后一次洗板结束，将板倒置，在吸水纸拍干所有残留液体；在每个微孔内加入 100 μL 酶标检测抗体。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育 2 小时。重复第 4 步洗板操作，在每个微孔内加入 100 μL 显色底物，室温孵育 30 分钟。注意避光。在每个微孔内加入100 μL 终止液后 30 分钟内，使用酶标仪测量 450 nm 的吸光度值。计算结果。 4. 小鼠外周血T淋巴细胞亚群及B淋巴细胞比例流式检测 离心机4℃预冷。小鼠摘眼球取血，向装有10 ml 1×PBS的15 ml离心管中加入3滴血（约150 μl），1600 rpm，5 min，室温离心；用移液管小心弃去上清，每管加入1 ml红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温裂解约5-10 min至液体从浑浊变澄清，加入10 ml PBS终止裂解，2000 rpm，5 min，4℃离心，弃上清（如果还有较多红细胞可重复进行步骤4）。细胞沉淀用10 ml PBS重悬，2000 rpm，5 min，4℃离心，弃上清，用200 μl封闭液（含5% FBS的PBS）重悬，并将细胞悬液转移至1.5 ml ep管中，4℃封闭30 min。避光于封闭液中配制流式抗体如下：FITC标记抗小鼠CD3e、PE标记抗小鼠CD19，PerCP-Cy5.5标记抗小鼠CD4、APC标记抗小鼠CD8a，每一管细胞的配制体积为：抗体各0.3 μl，封闭液50 μl。 细胞悬液2000 rpm，5 min，4℃离心，弃上清。加入流式抗体，每管50 μl，4℃避光染色30 min，加入1 ml PBS，2000 rpm，5 min，4℃离心，弃上清。用200 μl 含2% FBS的PBS重悬细胞，转移至流式管中，上机检测（如不能及时上机检测，可用PBS将4%多聚甲醛固定液稀释为2%，重悬细胞，每管体积为200 μl，4℃避光保存过夜）。 5. 肺组织病理学检查 取小鼠肺组织，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，切片，HE染色，中性树胶封片，显微镜下观察、照相。光学显微镜下观察小鼠肺部有无病理形态学改变，进行组间比较。

二、 评价指标体系：

1 体重模型组体重减轻，与正常对照组比较平均减轻>1g，视为造模成功。 2 肺部炎症模型组肺部炎症明显，肺指数（肺重g/100g体重）>0.9、且与正常对照组比有显著性差异视为造模成功。 3 肺组织病理变化肺组织甲醛固定，HE染色，×40倍放大。模型组镜下见肺组织弥漫性灶状肺泡坏死，肺泡支架塌陷，周围肺间隔增宽，肺间隔衬覆肺泡上皮增生伴巨噬细胞浸润，小血管损伤以内皮肿胀、增生伴血管外壁慢性炎细胞及少许急性炎细胞浸润。 4 肺组织中HCoV-229E核酸检测采用RT-PCR方法检测，正常对照组肺组织中HCoV-229E核酸检测阴性，模型组肺组织中HCoV-229E核酸检测阳性，。 5 肺组织炎性细胞因子检测ELLAS方法检测，模型组肺组织中IL-6、IL-10、TNF- a、INF-γ明显增高，且与正常对照组比有显著性差异视为造模成功。 6 外周全血免疫细胞检测

流式细胞仪检测，外周全血CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞及B细胞百分比降低，与正常对照组比有显著性差异视为造模成功。

7 小鼠肺部CT

三、验证结果

1实验材料

1.2受试药物

1.2实验动物

1.3实验试剂：同前

1.4实验仪器：同前

2实验方法

取BALB/c小鼠，SPF级，体重14±1g，雌雄各半，按体重等级随机分为正常对照组、模型对照组、受试药物各大剂量、小剂量组，每组10只。除正常对照组外，其余小鼠分别于第1天、第3天用乙醚轻度麻醉后，以100TCID50的 HCOV-229E病毒液滴鼻感染，50μL/只。第1天感染当天各给药组给药，0.2ml/10g，每日1次，连续4天，正常对照组和模型对照组在同等情况下灌胃给予蒸馏水。重组人干扰素α2b注射液采用雾化吸入给药，440万IU/kg/d，每次20分钟。感染第5天进行相关指标检测。 称重后眼眶取血，滴至生理盐水中备测淋巴细胞分型比例；其余血离心取血清，-20℃保存检测胃泌素(GAS)、胃动素(MTL)；解剖取肺脏称重，计算肺指数及抑制率；取部分肺组织-80℃留存备用，检测病毒载量和炎性细胞因子；取心、肝、脾、肺、肾、胃、肠，置于4%多聚甲醛固定，备用组织病理学检查。

3 动物模型考察指标结果及评估

图6-1 HCoV-229E感染小鼠肺炎模型肺部炎症表现及药物的治疗作用

图6-2 HCoV-229E感染小鼠肺炎模型肺部炎症表现及药物的治疗作用

注：组间比较，** P< 0.01**** P< 0.0001

图6结果显示：采用HCoV-229E感染小鼠后，小鼠肺指数明显增高，与正常对照组比较有显著性差异（P<0.01）；方剂2-2、方剂4-2、金花清感、疏风解毒、干扰素α2b在所试剂量内对HCoV-229E感染后小鼠肺指数有显著的降低作用，与模型对照组比较有统计学差异（P<0.01）。

图7 HCoV-229E感染小鼠肺炎模型肺组织中病毒核酸表达及药物的治疗作用

注：组间比较，** P< 0.01，**** P< 0.0001

图7结果显示：正常对照组动物肺组织中无HCoV-229E核酸表达；采用HcoV-229E感染小鼠后，小鼠肺肺组织中有明显核酸表达；给药方剂2-2、方剂4-2、金花清感提取物、疏风解毒提取物、磷酸氯喹和干扰素α2b可明显降低肺组织中病毒核酸表达量，与模型对照组比较有统计学差异（P<0.01）。

图8-1 HCoV-229E感染小鼠肺炎模型肺组织中炎性因子含量及药物的治疗作用

注：与正常对照组比较，## P < 0.01；与模型对照组比较，* P<0.05，** P<0.01

图8-2 HCoV-229E感染小鼠肺炎模型肺组织中炎性因子含量及药物的治疗作用

注：组间比较，**** P< 0.0001

图8结果显示：采用HcoV-229E感染小鼠后，小鼠肺组织炎性因子IL-6、IL-10及TNF-a均明显增高，与正常对照组比较有显著性差异（P<0.01，P<0.05）；方剂2-2、方剂4-2、金花清感提取物、疏风解毒提取物给药4天后对肺组织中IL-6、IL-10及TNF-a含量均有明显降低作用，与模型对照组比较有显著性差异（P<0.01）。磷酸氯喹和干扰素α2b给药4天后对肺组织中TNF-a含量有明显降低作用，与模型对照组比较有显著性差异（P<0.01, P<0.05）。

图9-1 HCoV-229E感染小鼠肺炎模型外周血免疫细胞比例及药物的治疗作用

注：组间比较，*P< 0.05，** P< 0.01，*** P< 0.001

图9-2 HCoV-229E感染小鼠肺炎模型外周血免疫细胞比例及药物的治疗作用

注：组间比较，*P< 0.05，*** P< 0.001，**** P< 0.0001

图9结果显示：采用HCoV-229E感染小鼠后，小鼠外周血中免疫细胞CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞及B细胞的百分比均明显降低，与正常对照组比较有显著性差异（P<0.05、P<0.01）；受试药物给药4天后对以上免疫细胞有不同程度影响，处方2-2大剂量组可升高B细胞的百分比；处方4-2小剂量组可升高CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞及B细胞的百分比；金花清感提取物小剂量组可升高CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞百分比；疏风解毒浸膏大剂量组可升高B细胞的百分比，小剂量组可升高CD3+T细胞、CD4+T细胞百分比；磷酸氯喹可以升高CD8+T细胞百分比，与模型对照组比较有显著性差异（P<0.05，P<0.01）。干扰素α2b对免疫细胞无显著影响，CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞及B细胞的百分比均无明显变化，与模型对照组比较无显著性差异（P>0.05）。

本ABSL-2生物安全实验室是国内最早进行中药抗病毒研究的单位，也是目前唯一专门从事中药抗病原微生物感染的机构。主要研究领域为中药抗感染相关基础研究和新药研发。

本实验室生物安全管理满足中华人民共和国国家标准《实验室生物安全通用要求》（GB 19489-2008）和《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院令第424号）的有关规定，同时满足中国合格评定国家认可委员会《实验室生物安全认可准则》（-CL05:2009）、《实验室生物安全认可准则对关键防护设备评价的应用说明》（-CL05-A002）的要求。本实验室的生物安全管理方针是：安全第一、恪守法规、制度健全、活动规范、预防为主、责任为先。本实验室对于菌（毒）株的管理严格，采用双人双锁管理。

本实验室的生物安全管理目标是：①生物安全事件发生率为零；②可识别的生物安全操作差错小于5次/年；③差错调查处理率100％；④生物安全人员培训覆盖率100%；⑤生物安全工作持证上岗率100%；⑥生物安全仪器设备完好率100%。

本实验室为强化实验室生物安全意识，提高管理水平和工作效率，保证实验室工作正常开展，承诺如下：①本实验室承诺遵守国家以及地方相关法规和标准；②本实验室承诺遵守良好职业规范和安全管理体系；③本实验室承诺和切实履行，在本实验室职责范围内，对所有员工、来访者、合同方、社区和环境的安全负责；④本实验室安全管理的宗旨是精心操作，认真记录，严格审核，最低限度减少差错，确保实验结果准确，安全报告无误。

本实验室的工作在中药研究所生物安全管理委员会的领导和监督下进行，为更好的管理本生物安全实验室，实验室建立了生物安全管理体系，相关体系文件包括：《生物安全管理手册》、《程序性文件》、《标准操作规程》、《记录表格》。本实验室的日常工作严格按照体系文件的要求进行。

1监督管理

本实验室建有《生物安全监督、检查控制程序》，用于安全监督及安全检查工作的过程控制。本动物模型制备过程严格尊照《生物安全监督、检查控制程序》规范本实验室安全监督工作，及时发现潜在的安全隐患或违反本实验室安全管理的操作行为。安全监督的方式包括：现场目击实验人员的工作过程；通过监控系统实时监督；对各项安全活动的记录进行检查分析。安全监督的内容包括：实验操作是否满足相关安全要求；对溢撒、泄露等事故处置是否满足安全操作程序规定。

2处置措施

为确保动物模型制备操作过程中涉及生物安全体系的有效运行，本实验室根据实验对象、生物危害程度评估、研究内容、设施特点、设备情况制定相应的标准操作程序，对于任何偏离生物安全体系或标准操作程序，制订和实施纠正措施，防止不符合和偏离实验目的的情况发生。

3微生物菌株管理

3.1本实验室建有《微生物菌（毒）种管理程序》，用于确保微生物菌（毒）种的安全、规范保存及使用，实现微生物菌（毒）种资源保存及使用管理程序的规范化。

3.2本实验室有固定的菌毒种供货渠道。所有菌毒种的采购必须由固定的供应商购买或由国家单位赠予并签订赠予合同。菌毒种的供应商必须满足国家有关法律法规的要求。

3.3本实验室的菌毒种仅供本实验室使用，任何人都不得随便送与他人，也不得与他人做任何交流使用。

3.4对于微生物菌株实行双人双管制度，本实验室设置两名“菌（毒）株管理员”，共同负责对菌毒种的管理。涉及菌毒种的所有运作，如接收、登记、发放、检查等都必须由两人同时进行。

3.5每个菌（毒）株管理员各持一把钥匙。菌（毒）株管理员手中的钥匙只能自己使用，不得随便交与他人，必要时经实验室主任批准并作登记。

3.6菌毒种必须在特定的区域和设备中保管，严禁随意将菌、毒种置于非菌、毒种专用保存场所。

3.7菌毒种使用人员在实验完成后，必须按规定将剩余菌毒种及时销毁。

4细胞系描述

4.1 A549人肺癌细胞，批号：337696，订购单位：北京北纳创联生物技术研究院。

4.1.1培养条件：37℃，5%CO2，CM7-1培养液。CM7-1培养液：90%F-12K+10%FBS。F-12K：F-12K培养液。

4.1.2复苏步骤：①新制100mm平皿1个，含12ml上述培养液；②冻存管从液氮或-80℃中取出，37℃水浴1～2min，待完全溶解后尽快移入安全柜复苏；③用无菌吸管吸取溶解液打入新制平皿中，顺时针摇匀；④放入（37℃，5%CO2）培养箱中，过夜换液，2～4天长满。

4.1.3传代/冻存：将旧培养液吸除，PBS清洗两遍后，加入6ml（/100mm皿）胰酶，在显微镜下观察，期间禁止摇晃培养皿，细胞刚有脱落时，则吸除大部分胰酶，留约0.5ml，移至培养箱消化，约3min取出。传代用12mlCM7-1培养液终止消化，轻轻吹打均匀细胞，后可分3～6皿培养；冻存则用6ml冻存液（90%FBS+10%DMSO）终止消化，吹打均匀，分为6支冻存管，用程序降温盒于-80℃冻存。

4.2巨噬细胞，由中国医学科学院惠赠。

4.2.1培养条件：37℃，5%CO2，DMEM培养液。细胞培养液：90%DMEM +10%FBS。DMEM：DMEM高糖培养液。

4.2.2复苏步骤：①新制100mm平皿1个，含12ml上述培养液；②冻存管从液氮或-80℃中取出，37℃水浴1～2min，待完全溶解后尽快移入安全柜复苏；③用无菌吸管吸取溶解液打入新制平皿中，顺时针摇匀；④放入（37℃，5%CO2）培养箱中，过夜换液，2～4天长满。

4.2.3传代/冻存：将旧培养液吸除，PBS清洗两遍后，加入6Ml（/100mm 皿）胰酶，在显微镜下观察，期间禁止摇晃培养皿，细胞刚有脱落时，则吸除大部分胰酶，留约0.5ml，移至培养箱消化，约5min取出。传代用12ml细胞培养液终止消化，轻轻吹打均匀细胞，后可分3～6皿培养；冻存则用6ml冻存液（90%FBS+10%DMSO）终止消化，吹打均匀，分为6支冻存管，用程序降温盒于-80℃冻存。

4.3 MDCK犬肾细胞，批号,337866，订购单位：北京北纳创联生物技术研究院。

4.3.1培养条件：37℃，5%CO2，CM1-1培养液。CM1-1培养液：90%DMEM-H+10%FBS。DMEM-H：DMEM高糖培养液，含谷氨酰胺，含丙酮酸钠。

4.3.2复苏步骤：①新制100mm平皿1个，含12ml上述培养液；②冻存管从液氮或-80℃中取出，37℃水浴1～2min，待完全溶解后尽快移入安全柜复苏；③用无菌吸管吸取溶解液打入新制平皿中，顺时针摇匀；④放入（37℃，5%CO2）培养箱中，过夜换液，2～4天长满。

4.3.3传代/冻存：将旧培养液吸除，PBS清洗两遍后，加入6Ml（/100mm 皿）胰酶，在显微镜下观察，期间禁止摇晃培养皿，细胞刚有脱落时，则吸除大部分胰酶，留约0.5ml，移至培养箱消化，约5min取出。传代用12mlCM1-1培养液终止消化，轻轻吹打均匀细胞，后可分3～6皿培养；冻存则用6ml冻存液（90%FBS+10%DMSO）终止消化，吹打均匀，分为6支冻存管，用程序降温盒于-80℃冻存。

4.4 M2C-5由中国医学科学院惠赠。

4.4.1培养条件：37℃，5%CO2，DMEM培养液。细胞培养液：90%DMEM+10%FBS。DMEM：DMEM高糖培养液。

4.4.2复苏步骤：①新制100mm平皿1个，含12ml上述培养液；②冻存管从液氮或-80℃中取出，37℃水浴1～2min，待完全溶解后尽快移入安全柜复苏；③用无菌吸管吸取溶解液打入新制平皿中，顺时针摇匀；④放入（37℃，5%CO2）培养箱中，过夜换液，2～4天长满。

4.4.3传代/冻存：将旧培养液吸除，PBS清洗两遍后，加入6Ml（/100mm 皿）胰酶，在显微镜下观察，期间禁止摇晃培养皿，细胞刚有脱落时，则吸除大部分胰酶，留约0.5ml，移至培养箱消化，约5min取出。传代用12ml细胞培养液终止消化，轻轻吹打均匀细胞，后可分3～6皿培养；冻存则用6ml冻存液（90%FBS+10%DMSO）终止消化，吹打均匀，分为6支冻存管，用程序降温盒于-80℃冻存。

5遗传分析

5.1 BALB/c小鼠，近交系小鼠，特征：低发乳腺肿瘤，老龄易发心脏病和多发动脉硬化，对X-射线敏感，对鼠沙门菌敏感，对麻疹病毒中度敏感。

5.2 BALB/c-nu(nude)裸鼠，突变基因鼠，是一种11号染色体上隐性裸基因(nu)发生突变的小鼠。裸鼠表皮无毛，胸腺先天性缺陷，发育不全，T淋巴细胞缺损，缺乏免疫应答性，致使免疫机能低下，易受外界细菌和病毒的侵染而发生疾病。纯合的新生仔鼠无鼻毛或有少量卷曲鼻毛，普通环境下存活14～30d，SPF及无菌条件下寿命达1年以上，最长2年。

5.3ICR小鼠，封闭群小鼠，此鼠普遍应用于药物安全性评价、药效药理实验和免疫学等方面的研究。

6对环境和生态影响的评估

6.1实验室设计参数。温度：20～26°C；日温差：≤4°C；相对湿度：40%～70%；换气次数：15～20次/h；气流速度：≤0．2m/s；压强梯度：20～50Pa；空气洁净度：7级；菌落数：≤3个/皿；氨浓度：≤14mg/m3；噪声：≤60dB；最低工作照度：≥200lx；动物照度：15～20lx；昼夜明暗交替时间：12/12h。

6.2实验室通风和空调系统。采用全新风中央空调通风系统。空气经过初、中、三级过滤器后进入实验室内环境。空调设备位于初、中效过滤器之间，由一套单元式机组，机组有两台压缩机，相互独立，一用一备，保证整个系统的正常运行。送风口位于压缩装置一侧，离地0.25m。

所有微生物及污染物按标准的生物安全操作流程执行，统一高压灭菌后由中国中医科学院中药研究所交由北京金州安洁污物处理有限公司处理，不会对周围环境及生态造成影响。

1技术方法及指标体系

在本模型研究过程中，首先对保证HCoV-229E病毒存活性的体外细胞培养体系进行了研究，共对体外培养MDCK、A549、MRC-5以及人类巨噬细胞4种细胞的易感性进行了评价，从病变程度、出现时间、稳定性、保存等方面最终选取了A549细胞、MDCK细胞做为病毒增殖载体；在进一步进行动物感染研究中，对A549细胞、MDCK细胞两种病毒液进行了对比；对两种不同病毒液的不同滴度进行了筛选；采用肺部炎症和肺组织中病毒核酸检测对ICR小鼠、BALB/c、BALB/c-nude的易感性进行了评价，对不同感染次数和感染量进行了筛选、观察了模型稳定持续时间，最终确定：采用HCoV-229E病毒感染的A549病毒液、滴度为100TCID50、BALB/c小鼠，感染2次的方法进行造模，所形成的的模型符合研究要求。具体方法如下：

1.1主要造模方法

取BALB/c小鼠20只，SPF级，体重14±1g，雌雄各半，按体重等级随机分为正常对照组、HCoV-229E模型组，每组10只。HCoV-229E模型组小鼠分别于第1天、第3天用乙醚轻度麻醉后，以100TCID50的 HCOV-229E病毒液滴鼻感染，50μL/只。正常对照组在同等条件下滴鼻生理盐水。感染第5天进行相关指标检测。称重后眼眶取血，滴至生理盐水中备测淋巴细胞分型比例；解剖取肺脏称重，计算肺指数及抑制率；取部分肺组织-80℃留存备用，检测病毒载量和炎性细胞因子；取心、肝、脾、肺、肾、胃、肠，置于4%多聚甲醛固定，备用组织病理学检查。

1.2指标体系

体重：模型组体重减轻，与临床疾病一致。与正常对照组比较平均减轻>1g，视为造模成功。

肺部炎症：肺部炎症明显，与临床疾病一致。肺指数（肺重g/100g体重）>0.9，且与正常对照组比有显著性差异，视为造模成功。

肺组织病理变化：与临床肺部急性炎症表现一致。肺组织甲醛固定，HE染色，×40倍放大，镜下见肺组织弥漫性灶状肺泡坏死，肺泡支架塌陷，周围肺间隔增宽，肺间隔衬覆肺泡上皮增生伴巨噬细胞浸润，小血管损 伤以内皮肿胀、增生伴血管外壁慢性炎细胞及少许急性炎细胞浸润。

肺组织中HCoV-229E核酸检测：采用RT-PCR方法检测，肺组织中HCoV-229E核酸检测阳性，与临床一致。正常对照组肺组织中HCoV-229E核酸检测阴性。

肺组织炎性细胞因子检测：ELLAS方法检测，肺组织中IL-6、IL-10、TNF- a、INF-γ明显增高，与临床疾病一致。且与正常对照组比有显著性差异视为造模成功。

外周全血免疫细胞检测：流式细胞仪检测，外周全血CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞及B细胞百分比降低，与临床疾病一致，且与正常对照组比有显著性差异视为造模成功。

2与国内外现有模型的异同

目前，HCoV-229E感染BALB/c小鼠的模型，国内外尚无报道，Caroline Lassnig等人采用HCoV-229E感染APN转基因小鼠获得了成功[26]。但是与转基因小鼠相比，本模型所采用的BALB/c小鼠来源广泛、价格便宜、更易于饲养繁殖、不需要特殊实验室条件，SPF级即可。

另外，目前国内外已经有报道成功构建的冠状病毒感染的动物模型包括：MERS-CoV感染转基因小鼠模型[8]，MERS-CoV感染人原化小鼠模型[9]，MERS-CoV感染恒河猴模型[10-12]，MERS-CoV感染狨猴模型[13]，MERS-CoV感染单峰驼模型[14]；SARS-CoV感染食蟹猴、恒河猴、非洲绿猴、狨猴模型[15-19]，SARS-CoV感染小鼠模型[20-22]，SARS-CoV感染仓鼠模型[23]，MERS-CoV感染猫科动物模型[24-25]，SARS-CoV感染雪貂模型[24]。这些模型主要是针对MERS-CoV、SARS-CoV感染，主要用做病原学研究、疫苗的研制及致病机制研究，且由于实验操作受P3/P4条件限制、动物来源有限及成本高，而难以日常应用推广，尤其在新药研发中对药物筛选和药效评价时受到极大限制。

3技术难点

本“HCoV-229E感染BALB/c小鼠肺炎模型”在制备过程中存在的技术难点如下：

3.1 HCoV-229E传代细胞系的选择

本模型共筛选了2个细胞系：MDCK及A549，最终通过病毒核酸检测确定A549细胞传代的HCoV-229E滴度更高。

3.2小鼠品系的选择

本模型共筛选了3个小鼠品系：BALB/c小鼠、BALB/c-nude小鼠及ICR小鼠。通过病毒滴鼻感染后肺组织病毒核酸检测确定BALB/c小鼠感染后肺部病变最严重，肺组织内病毒载量最高。

3.3感染次数的选择

本实验摸索了单次感染和两次感染两个条件，结果确定双次感染的小鼠肺部病变更严重，肺组织内病毒载量更高。

3.4有关感染动物周龄及体重的选择

我们在本次模型研究中对动物周龄及体重进行了比较，如果采用体重17g以上的动物感染不易成功，这也是模型成功与否的关键环节之一。

20年来我们一直从事呼吸道感染模型的建立、药效评价及方法学研究，在其他呼吸道感染模型中也同样表现出这个现象，如流感病毒感染小鼠肺炎模型、呼吸道合胞病毒感染小鼠模型、链球菌、铜绿假单胞菌以及肺炎双球菌感染小鼠肺炎模型建立时都是采用幼龄小鼠。这类模型在20年来我们已做了大量新药评价，均被CFDA所认可。另外，相关文献报道中也都采用幼龄鼠。

在临床疾病中COV-229E感染通常引起的是上呼吸道感染，但在幼儿、老年人、免疫功能低下以及有基础疾病的人群中则容易引起肺部炎症，或重症肺炎。因此，这与模型采用幼龄鼠易感相吻合。虽然幼龄动物免疫力较弱但免疫功能健全，有别于免疫缺陷小鼠，其病理生理变化较能符合疾病的基本情况。

模型的建立属于方法学研究，更重要的是基于实际结果来确定，对于各项关键环节都要是通过实验确定，最终目的是达到建模的要求和目的、符合建模的应用范围。由于人类基本和小鼠模型之间确实存在一定的种属差异，所以通常采用幼龄动物保证感染成功。

3.5常见技术难点解答

① 我们在研究中，229E在体外可感染4种不同细胞，均可产生明显的典型细胞病变，其中A549、MRC-5病毒液均可感染小鼠产生肺部炎症表现，我们在申报模型鉴定时提供的感染A549病毒液，因感染达到预期目的，所以没有同时进行小鼠肺部适应，可以在以后模型的应用中进一步观察、比较。

② 本研究中有关于体重的观察，感染后小鼠体重减轻明显，约在1g左右。

③ 小鼠血清量有限，每只大约200ul，不能同时进行太多指标的观察。由于调节免疫功能是中药治疗感染的优势及特点，所以我们在模型评价指标中设立了观察外周血免疫细胞百分比。在以往的研究中我们也观察到，在其他病毒感染小鼠肺炎模型上小鼠血清中炎性细胞因子含量极低且不稳定，所以我们设定观察肺组织中炎性细胞因子，含量较高且结果稳定。另外，也有大量文献报道流感病毒感染后小鼠肺组织中炎性因子含量明显增高[1]。

④ 小血管炎症指标我们在肺组织病理检查中有观察，表现为小血管内皮肿胀、血管周围炎性细胞浸润。

⑤ 外周血中CD4、CD8含量是我们模型的主要观察指标之一，所以二者之间的比值可以得出。

⑥ 有关病毒复制情况，我们检测了小鼠肺组织中COV-229E病毒核酸表达，正常肺组织无表达，感染后肺组织可表现出高表达，提示有病毒存在；小鼠肺组织匀浆可使培养细胞产生明显的病变并病毒滴度很高，说明肺组织中有高浓度病毒存活，这二者是说明成功感染的金指标。

⑦ 病毒感染后特异性抗体的产生大约15天左右，本模型维持时间为1周，所以检测不到特异性抗体。

4．创新性

本模型属国内外首次成功构建的HCoV-229E感染BALB/c小鼠肺炎模型。

5．应用价值

① 本模型可以用来进行抗病毒药物筛选及评价。目前，国内外尚无针对HCoV-229E的特效抗病毒药物，但是由于近20年来冠状病毒感染引起的呼吸道感染越来越多，相关抗病毒药物的研发迫在眉睫，因此与药物研发相关动物模型的开发极其重要。

② 本模型可以用来评价治疗呼吸道感染相关中药。目前，虽然治疗呼吸道感染的中药很多，且疗效很好，但是由于HCoV-229E引起的呼吸道感染一直未被重视，因此，本模型不仅可以用来评价中药新药，亦可以对上市药物进行新的适应症评价。

③ 本模型可以用来进行药理学研究。本模型在评价药效的同时，还可以用于药物的药理机制研究。例如，病理学改变，免疫学改变等。

6．有关与临床疾病的相似性

本模型肺部病理检查显示，双肺可明显肿胀，紫红色；切面可见肺组织呈斑块状实变或大片实变，可有暗红色液体流出，血管可较明显。HE染色，×40倍放大，镜下见肺组织弥漫性灶状肺泡坏死，肺泡支架塌陷，周围肺间隔增宽，肺间隔衬覆肺泡上皮增生伴巨噬细胞浸润，小血管损伤以内皮肿胀、增生伴血管外壁慢性炎细胞及少许急性炎细胞浸润。

在临床中有关病毒性肺炎的病理表现，镜下可见局限性或弥漫性急性肺泡炎和间质炎。早期肺泡壁血管扩张、充血，间质内可见淋巴细胞浸润；肺泡腔内可见液体渗出，肺泡上皮细胞增生、肿胀或变性、坏死以致脱落，单核细胞或多核巨细胞、淋巴细胞和浆细胞渗出，或可有纤维素渗出，严重者发展为肺实变。有时可见肺泡腔内透明膜形成。肺泡上皮细胞胞质或核内病毒包涵体形成，提示病毒感染。间质小血管内可能有微血栓形成。病变进展到后期，肺泡内容物可能被液化吸收或咳出而消失，也可能被机化，伴有肺间质纤维化，肺膜纤维性增生，或造成肺泡纤维性闭塞。

因此，由HCoV-229E引起小鼠肺部病理变化和常见病毒性肺炎的病理变化相似。

7．重复性及稳定性

模型鉴定申报前，利用本模型已评价药物8种，包括新冠肺炎临床诊疗方案推荐的中药方剂3个，中成药3个，西药2个。申报后的后续应用中，采用此模型评价了6种药物，模型考察指标结果稳定，重复性好。将在以后的应用中继续评价。

8．标准化

8.1实验材料标准化

为确保采购材料和外部服务满足安全和技术工作需求，本实验室建有《服务与实验室材料控制程序》，对实验室材料的选择、购买、采集、接收、查验、使用、处置和存储，以及选择外部服务进行控制。适用于本实验室对安全和实验结果有影响的服务和供应品采购的全过程控制。

为确保微生物菌（毒）种的安全、规范保存及使用，实现微生物菌（毒）种资源保存及使用管理程序的规范化，本实验室构建《微生物菌（毒）种管理程序》。适用于本实验室所有微生物菌（毒）种的管理。

本次模型构建的实验材料依据本实验室标准，严格遵守《服务与实验室材料控制程序》、《微生物菌（毒）种管理程序》。

8.2实验过程标准化

本实验室建有《实验室活动管理程序》，对活动计划、申请、批准、实施、监督和评估等活动做出规定，以便具体工作人员更好、更准确、更地完成各项工作。适用于本实验室开展的所有实验和检测活动控制。

本实验室建有《标准操作规程（SOP）汇编》，本模型构建过程中的所有过程均严格遵守《标准操作规程（SOP）汇编》中的各项相关SOP。

8.3实验仪器标准化

为规范实验室中涉及生物安全的仪器设备的采购和验收、检定和校准、和仪器设备的安全去污，保证仪器设备的正常运转，保证生物危险因子对仪器设备的污染降低到最小程度，保证不能由仪器设备扩散出生物危险因子而造成环境和实验人员的污染，本实验室建有《实验室设施设备管理程序》。适用于实验室仪器设备的管理。本实验室的仪器设备实行年检制，每台仪器设备均有相应的标准操作规程（SOP）。

本模型的构建本模型构建过程中的所有过程均严格遵守《实验室设施设备管理程序》及各项标准操作规程。