DOCA高盐诱导主动脉瘤小鼠模型

一、疾病概述

主动脉瘤(aortic aneurysm) 指主动脉壁局部或弥漫性的异常扩张超过正常值 50%以上，压迫周围器官而引起症状，常发生在升主动脉主动脉弓、胸部降主动脉、胸腹主动脉和腹主动脉，其发病率在老年人群中可以高达5-10%，并呈上升趋势。主动脉瘤可由多种因素引起，如家族遗传、高血压、动脉硬化等，其主要病理改变为血管壁弹力纤维断裂及平滑肌细胞病变和血管外膜胶原沉积。

由于主动脉瘤是一种慢性血管炎症性疾病，近年来可以诱发血管炎症的多种因素与该疾病的发生机制研究一直被人们关注，包括盐皮质激素、血管紧张素II等，其中醋酸脱氧皮质酮（DOCA）是一种类固醇激素，可以与体内的盐皮质激素受体结合，影响机体内钠水代谢，进而诱发慢性炎症反应。有研究表明高盐加醋酸脱氧皮质酮（DOCA）缓释刺激可以通过激发血管的炎症反应而诱发小鼠动脉瘤的发生，并且该影响与年龄因素密切相关。本研究通过高盐加DOCA的方法建立小鼠血管瘤模型，并观察影响该疾病的相关通路因子，通过体内外实验增加或降低关键通路因子，进一步探索该疾病的病理生理发生机制，为该疾病的预防治疗提供新方法和思路。

二、模型背景

1、造模因素信息

DOCA 高盐诱导主动脉瘤小鼠模型

2、实验动物背景信息

C57BL/6小鼠

3、研究背景

在过去的几十年中，已经发展了几种主动脉瘤动物模型[1]。其中，血管紧张素II在APOE-/-和LDLR-/-小鼠体内输注诱导主动脉瘤的方法最为常见[2-7]。我们最近开发了一种新的小鼠主动脉瘤模型，方法是给C57bL/6J雄性小鼠注射盐皮质激素受体激动剂DOCA加高盐，而不是单纯的给予DOCA或高盐，可以诱发主动脉瘤的形成和破裂，这种模型具有年龄依赖性[8]。

与 ANGII灌注小鼠模型相比，DOCA+高盐小鼠模型显示了几个独特的特征，包括: (1)使用WT小鼠，而不是APOE-/-和LDLR-/-小鼠，避免了高脂血症对动脉瘤的潜在混淆作用; (2)使用200g/kg/day DOCA(足以诱发主动脉瘤)的小鼠注射，血浆醛固酮浓度增加到10.58 nm [8]，低于心力衰竭患者[9,10]。这表明DOCA+高盐模型是一种模拟人类疾病的病理模型，而不是由于使用了高剂量的感兴趣分子而引起关注的药理模型; (3) 使用10个月大的小鼠而不是10周大的小鼠(主要用于ANGII和其他模型)模拟人类主动脉瘤。

参考文献:

1.Lindsay ME, Dietz HC (2011) Lessons on thepathogenesis of aneurysm from heritable conditions. Nature 473:308–316

2.Cassis LA, Gupte M, Thayer S et al (2009) ANG IIinfusion promotes abdominal aortic aneurysms independent of increased bloodpressure in hypercholesterolemic mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol296:H1660–H1665

3. Cassis LA, Helton MJ, Howatt DA et al (2005)Aldosterone does not mediate angioII-induced atherosclerosis and abdominalaortic aneurysms. Br J Pharmacol 144:443–448

4. Daugherty A, Manning MW, Cassis LA(2000)Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms inapolipoprotein E-deficient mice. J Clin Invest 105:1605–1612

5. Rateri DL, Moorleghen JJ, Balakrishnan A et al(2011) Endothelial cell-specific deficiency of Ang II type 1a receptorsattenuates Ang II-induced ascending aortic aneurysms in LDL receptor−/− mice. Circ Res 108:574–581

6. Thomas M, Gavrila D, Mccormick ML et al (2006)Deletion of p47phox attenuates angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysmformation in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation 114:404–413

7. Zhang X, Thatcher SE, Rateri DL et al (2012)Transient exposure of neonatal female mice to testosterone abrogates the sexualdimorphism of abdominal aortic aneurysms. Circ Res 110:e73–e85

8. Liu S, Xie Z, Daugherty A et al (2013)Mineralocorticoid receptor agonists induce mouse aortic aneurysm formation andrupture in the presence of high salt. Arterioscler Thromb Vasc Biol33:1568–1579

9. Weber KT (2001) Aldosterone in congestive heartfailure. N Engl J Med 345:1689–1697

10. He BJ, Joiner ML, Singh MV et al (2011) Oxidationof CaMKII determines the cardio

toxic effects of aldosterone. Nat Med 17:1610–1618

1 实验材料

实验动物 选择健康雄性C57小鼠小鼠，体质量18-22 g，均购于北京华阜康华生物科技股份有限公司。饲养于中国医学科学院实验动物研究所动物中心动物房内，5只/盒屏障系统中，温度(22±2) ℃，湿度50%～60%，12h 循环照明，小鼠自由摄取食、水，IACUC号：ILAS-YZW17007。

2 方法

2.1 动物模型制备

C57小鼠根据体重，三溴乙醇麻醉0.18ml/10g体重，（360mg/kg体重）（三溴乙醇储存液：25g三溴乙醇+15.5ml叔戊醇，使用液：0.50ml储存液+39.5ml生理盐水），俯卧位固定于加热垫上保持体温，背部颈部脱毛膏脱毛，酒精消毒处理，无菌手术剪剪开后背颈部皮肤，用镊子将皮下探查出一个可以足够装下药品的空间，将DOCA 缓释泵塞入皮下，镊子将该处皮肤对齐复合，无菌缝合线缝合皮肤，放置在加热板上保暖，待苏醒后放回鼠盒，手术后用止痛果冻缓解疼痛。

2.2 标本采集及处理

完成DOCA+高盐干预21天后，称体重，麻醉后腹主动脉采血至死亡，室温静置2h后于4℃3000r离心10分钟提取血清，-80℃冰箱冻存。取心脏、主动脉做石蜡切片，10%中性福尔马林中固定，30%蔗糖脱水，冰冻切片包埋剂包埋并切片；进行免疫组化及免疫荧光检测，其余血管组织液氮冷冻-80℃保存，提取蛋白进行免疫印迹检测。

1. 大体及超声结果分析

2.主动脉瘤冰冻切片HE及马松染色

3. 血管浸润免疫细胞染色分析

主动脉夹层瘤患者的临床特征：主动脉夹层瘤导致的主动脉直径增厚超过50%。

该法造模的特点：大体及超声检测能够发现主动脉直径增厚超过50%；夹层瘤部冰冻切片HE 及马松染色可见夹层瘤形成，纤维化加剧，弹力纤维增厚。

动物模型制备过程中，由饲养人员进行日常饲喂，由兽医进行监督管理，造模期间动物状态良好，每天记录病死只数，造模选用DOCA加高盐喂水，对动物伤害小，每周称重一次，未使用微生物，对环境没有影响，造模方法简便易，行重复性好，不可遗传。