睡眠干扰/剥夺所致小鼠学习记忆障碍模型

随着现代社会发展，生活节奏加快、工作压力大、生活方式不健康等因素导致很大一部分群体长期处于慢性睡眠干扰的状态[1]。据世界卫生组织报道，睡眠障碍是当今世界一个应该得到重视和解决的公共卫生现状问题。目前睡眠障碍率达27%，而我国存在睡眠问题人口率则高达38.2%，甚至高于世界平均水平，即平均每四人中就有一人存在睡眠障碍问题。此外，航空、航天、航海等军事特因环境下，由于昼夜生物节律颠倒，睡眠周期紊乱，睡眠不足或睡眠障碍，造成作业人员机体免疫力、作业能力、警觉性和判断力降低，影响作业任务的完成，严重者危及生命。现代研究表明，睡眠是个体生存发育所必需的一项重要生理活动, 其对机体的能量平衡、免疫机能、学习的形成及维持记忆等起到关键作用[2, 3]，一旦睡眠障碍/干扰会引起情绪、认知功能以及免疫功能等一系列的改变, 伴随疲劳的增加, 可引起生理、心理甚至行为的变化[4, 5]。睡眠干扰(Sleep Interruption，SI)是指由于环境或自身原因无法满足正常睡眠的情况，一般指在24小时中的睡眠小于4小时。睡眠干扰可以分为部分睡眠干扰（partialsleep interruption, PSI）和完全睡眠干扰（total sleep interruption, TSI）。TSI指24h之内完全无睡眠；PSI一般指24h之内睡眠量通常达不到4h。研究已证实无论是部分睡眠干扰或是完全睡眠干扰均会对学习记忆功能产生损害[6]，此外睡眠干扰与诸如阿尔茨海默病、帕金森氏病、脑血管疾病等多种中枢神经系统疾病高度相关[7, 8]。针对睡眠干扰的诸多危害和缺乏有效对抗手段的现状，临床前研究选择合适的动物模型模拟睡眠干扰产生的效应对于解释睡眠干扰所致学习记忆障碍的分子机制并寻求特异防护手段意义重大。

目前睡眠干扰方法分为两类：化学诱导法和物理因素干扰法。其中化学诱导法多采用对动物进行注射中枢兴奋类化学药物（如咖啡因、去氧麻黄碱、神经毒素(DSP-4)、可乐定等）部分或全部剥夺睡眠，该类方法由于存在动物个体差异较大、不易掌握等问题而应用较少。物理因素诱导睡眠干扰方法主要包括小平台水环境、滚筒、水平转盘、跑台、人工轻触刺激等。由于小平台水环境法因频繁落水造成物溺水死亡率高、人工轻触刺激需要消耗实验人员的体力而较少应用。目前应用较多的滚筒、水平转盘和跑台等。本模型采用滚筒式对小鼠进行睡眠干扰建立稳定的学习记忆障碍模型。

参考文献：

[1] 冯忠胜, 汤永红. 睡眠剥夺致相关功能障碍的研究进展[J]. 世界睡眠医学杂志. 2018; 5(7): 866-870.

[2] AlhaiderIA, Aleisa AM, Tran TT, Alzoubi KH, AlkadhiKA. Chronic caffeine treatment prevents sleep deprivation-induced impairment ofcognitive function and synaptic plasticity[J]. Sleep.2010; 33:437-444.

[3] Xie L, Kang H, Xu Q, Chen MJ, Liao Y,Thiyagarajan M, O'Donnell J, Christensen DJ, Nicholson C, Iliff JJ, Takano T,Deane R, Nedergaard M. Sleep drives metabolite clearance from the adultbrain[J]. Science.2013; 342: 373–3.

[4]Venancio DP, Andersen ML, Vilamaior PS．Sleep deprivation alters rat ventral prostatemorphology, leading to glandular atrophy: a microscopic study contrasted withthe hormonal assay[J].J Biomed Biotechnol.2012;12: 285938．

[5]杨遥,刘静, 徐江涛. 睡眠剥夺对认知功能的影响研究进展[J]. 现代生物医学进展. 2013;13(4)：791-794.

[6]Duclos C, Beauregard MP, Bottari C.The impactofpoor sleep on cognition and activities of daily living after traumatic braininjury: a review[J]．AustOccupTher J. 2015; 62( 1) : 2-12．

[7]Adriano DS, Targa AC, Noseda D, Rodrigues LS, AurichMF, Lima M.S. REM sleep deprivation and dopaminergic D2 receptors modulationincrease recognition memory in an animal model of Parkinson’s disease[J].Behav BrainRes. 2018; 339:239-248.

[8]孙晓倩. 睡眠剥夺与中枢神经系统疾病关系的研究进展[J]. 天津医科大学学报. 2018;24(5): 461-465.

1 动物：SPF级，ICR小鼠（4周龄；20±2g），雄性

2 仪器：滚筒式睡眠干扰仪(由中国航天员科研训练中心、中国医学科学院药用植物研究所和北京鑫海华仪科技有限公司联合研制)

3实验环境：隔音并且稳定的SPF级动物房和睡眠干扰室环境（温度：23-25℃，湿度：55%。12h/12h明暗周期）。动物购进后，在动物房适应7天后方可进行实验。

4模型诱导方法：睡眠干扰采用滚筒式睡眠干扰仪装置进行，造模方法如下：首先进行为期3天的睡眠干扰适应期，（1）将睡眠干扰仪一侧滚筒壁打开，把特定水瓶装满动物饮用水后，与食物一起放入睡眠干扰仪食盒，再将睡眠干扰组小鼠放入仪器中，一组小鼠放入睡眠干扰仪的一个室，关闭打开的滚筒壁。（2）设置仪器参数，参数如下：转速60s/圈，转圈1圈，休息时间2m。设置完成后，选择“开始”，按“ENT”键开始实验。（3）每天适应3小时（8-11AM），适应时间到3小时，选择“结束”，按“ENT”键停止实验，打开滚筒壁取出动物，放回动物房，连续适应3天。随后进行模型建立：将睡眠干扰组小鼠按上述步骤放入睡眠干扰仪，设置仪器参数，进行连续睡眠干扰14天。每天定期选择“结束”，按“ENT”键停止实验，打开滚筒壁，打开食盒加食加水，然后关闭食盒，关闭打开的滚筒壁，选择“开始”，按“ENT”键开始实验。睡眠干扰第14天开始进行认知行为学实验检测。检测开始前，取出动物，放到相应的检测室进行检测，在行为学检测时应尽量减少动物的非干扰时间，检测完后及时放回滚筒内继续干扰。

图1 滚筒式睡眠干扰仪图（国家发明专利授权号：201210356645.X）

1材料

（1）试剂：小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫分析测试盒、小鼠白细胞介素6（IL-6）酶联免疫分析测试盒和小鼠白细胞介素IL- 1β（IL-1β）酶联免疫分析测试盒（R&D公司，USA），小鼠总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒和还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国江苏）

（2）仪器：

①行为学检测：小鼠空场实验实时检测系统、物体认知实验检测装置、小鼠Morris水迷宫实时在线检测分析系统

②氧化应激、炎性因子相关指标检测：电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）、电热温培养箱（上海科学仪器有限公司）、低温高速离心机、移液枪（德国Eppendorf公司）、全自动波长多功能酶标仪（瑞士 Tecan 公司）。

2评价方法

（1）行为学评价:

①空场实验

空场实验发生于小鼠多功能空场实时检测装置内, 用于检测动物的自主活动情况。该仪器由4个（30 cm × 28 cm × 35 cm）箱体组成,每个箱子上方有 120 Lux 的光源, 并有摄像头对动物的运动进行监测。检测当天取出对照组和睡眠干扰仪内模型组小鼠后, 将小鼠置于空场测试箱的中央, 先适应3 min, 随后系统实时在线软件自动记录接下来10 min内小鼠的总路程和平均速度, 作为评价自主活动的指标。每次实验结束后, 用75% 酒精擦洗箱体底板, 避免气味对动物产生影响。

② 物体位置识别实验

物体位置识别实验用于评价动物的短时空间记忆能力, 发生于物体认知检测装置。该装置由4个黑色聚酯塑料材质构成的封闭箱（60 cm × 40 cm × 80 cm）构成, 箱体左右两侧各有两排LED灯条照明, 顶部采用摄像头观察动物的活动情况及探索过程。箱体内部使用黑色PVC材料, 箱底板喷以黑色哑光漆并用砂纸打磨以避免反光, 底板可抽出便于清洗动物残屑物。

实验包括3个阶段：适应期、熟悉期和测试期。适应期为期3天,将动物背对箱体依次放入实验箱中部位置使之自由活动, 10 min/只/d, 1 次/d。适应结束后, 次日进行熟悉期和测试期。熟悉期时, 将两个完全相同的物体放入实验箱内相邻的磁铁处固定, 记录小鼠5 min内对两物体的探索行为, 比较动物对熟悉物体A1和熟悉物体A2的探索时间来评价动物对物体所在位置是否存在偏爱性, 用动物对物体对的总探索时间来评价动物对两物体的总探索能力是否处于同一水平。间隔30 min后开始测试期, 将其中一个熟悉物体改变位置, 移动至新的位置。记录小鼠在5 min的测试期内分别对变化位置后物体（“新物体”）（TN）和原熟悉物体的探索时间（TF）, 用相对辨别指数（discrimination index, DI）来评价动物的记忆能力。相对辨别指数计算公式为DI =(TN-TF)/(TN+TF)。

③ 新物体识别实验

新物体识别实验同样发生于物体识别系统内, 实验流程同样包括3个阶段: 适应期（10 min/d, 连续3d）;熟悉期（5 min）和测试期（5 min）。其中适应期和熟悉期的实验步骤同物体位置识别实验一样, 只是测试期时有所不同: 在新物体识别实验的测试期, 将其中一个熟悉物体变换为新物体, 另一熟悉物体保持不变。记录小鼠在测试期内分别对新颖物体（TN）和原熟悉物体（TF）的探索时间, 识别能力同样用相对辨别指数（DI）来表示。其反应的是动物的短时、非空间记忆能力。

④Morris水迷宫实验

Morris水迷宫实验是一种经典的评价动物空间参考记忆能力的认知行为检测方法。本实验所采用的实时在线检测系统由一个不锈钢喷塑圆柱形水池和图像采集分析系统两部分组成。水池直径为100 cm,高38 cm, 并且水温维持在23 ± 2 °C。加入墨汁使之浑浊，水池被平均划分为4个象限, 软件记录为1,2,3,4四个象限。一圆柱形平台（直径6 cm, 高15 cm）被置于低于水面1 cm 的其中一象限内, 上方安装有摄像头用于监控动物游泳情况。

实验分为定位航行阶段（5 d）和空间探索阶段(1 d)。首先开始为期5天的定航训练, 开始前先将动物放在平台上适应10 s, 然后随机选取1个入水点, 将动物放入水中, 给予90 s 寻求平台, 若成功找到平台则让其在平台上停留10 s再归笼, 若未找到平台则引导动物至平台, 停留10 s。每天每只动物训练2次, 系统自动记录动物找到平台的时间（寻台潜伏期）作为评价学习记忆能力的指标。于第6天,撤去平台, 以目标象限的对角象限中点为入水点, 将动物面向池壁放入水中, 检测 90 s, 记录动物在目标象限的穿台次数作为评价指标,用来检测动物对平台空间位置的准确记忆, 即记忆保持能力。

（2）氧化应激指标检测

分别将小鼠的皮层和海马组织与冷生理盐水超声混合（1: 9）, 然后将混匀液于3500 rpm（10 min, 4 °C）离心, 取上清液用于生化检测。按照南京建成生物工程研究所的T-AOC, SOD, MDA和 GSH生化试剂盒说明书步骤分别检测皮层和海马内的T-AOC, SOD活性和MDA和 GSH的含量。

（3）血清内促炎因子检测

血清内促炎因子TNF-α, IL-6和IL-1β的含量测定按照ELISA试剂盒说明书进行。

3评价结果

（1）行为学结果：

①空场实验

睡眠干扰对小鼠自主活动的影响注：A总路程(cm)；B平均速度(cm/s)。② 物体位置识别实验 熟悉期结果如图3（A）和（B）所示, 睡眠干扰14天未对小鼠的探索能力产生影响, 且各组小鼠对两熟悉物体的探索时间亦未见差异, 表明所有动物对两熟悉物体无偏爱性。在测试期,睡眠干扰14天后小鼠的物体位置识别能力明显下降（P<0.05），表明小鼠的短时、空间学习记忆能力受损。

③ 新物体识别实验

④Morris水迷宫实验

在定位航行阶段, 随着训练天数的增加,各组动物的寻台潜伏期逐渐缩短, 而与对照组相比, 睡眠干扰模型组从第3天至第5天的潜伏期均显著性增加（P<0.05）, 表明睡眠干扰14天能损害小鼠的空间学习记忆能力, 使得模型动物的认知功能受损。探索实验结果（图5B）表明, 睡眠干扰模型组的穿台次数明显减少（P<0.05），表明其对空间参考记忆亦有改善作用。

（2）氧化应激指标检测

睡眠干扰14天后模型小鼠皮层和海马内的氧化应激水平显著升高, 表现为T-AOC和SOD活性显著性下降, 而MDA水平则明显升高, 且GSH含量明显减少（P<0.05,P<0.01 or P<0.001），结果表明睡眠干扰引起脑内持续性氧化应激损伤可能是导致学习记忆能力下降的原因之一。

注：A皮层和海马内T-AOC活性；B皮层和海马内SOD活性；C皮层和海马内MDA水平；D皮层和海马内GSH含量。与对照组相比，#P<0.05， ##P<0.01，###P<0.001.

（3）炎性因子指标检测

对血清内促炎细胞因子（TNF-α, IL-6 and IL-1β）的含量进行测定, 结果如图7所示, 模型组小鼠血清内以上三种促炎细胞因子的含量均呈极显著性增加（P<0.001），表明睡眠干扰激活小鼠机体内的炎性反应，持续性炎性细胞因子释放可能是诱发小鼠学习记忆水平下降的另一原因。

注：A TNF-α水平；B IL-6水平；C IL-1β水平。与对照组相比，###P<0.001.

本实验采用健康成年SPF级小鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。饲养及实验操作均于具有检验合格资质的SPF级屏障动物室内进行，并且实验动物以完整的包装直接进入屏障实验室，观察适应7天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

滚筒式睡眠干扰法可模拟睡眠剥夺致小鼠学习记忆障碍，在物体位置识别实验、新物体识别实验和Morris水迷宫实验等认知行为学检测中均有体现。物体认知实验是基于啮齿类动物先天对新物体更加具有探索倾向性的原理而建立, 它无需对动物进行任何刺激, 使其在自由状态下进行学习, 更加贴近人类的学习记忆行为, 用于评价动物的短时学习记忆能力。作为其中一种实验模式的物体位置识别实验则主要用于反应动物的短时、空间记忆能力，而新物体识别实验则主要反映动物的短时、非空间学习记忆能力。采用本造模方法可使小鼠在物体位置识别实验中的相对辨别指数显著下降，说明模型小鼠的短时、空间记忆能力受损。新物体识别实验中发现模型小鼠在测试期的相对辨别指数明显下降，表明睡眠干扰可破坏小鼠的短时、非空间记忆能力。Morris水迷宫实验则是一种经典的海马依赖性认知行为检测方法, 被广泛用于空间认知能力的评价, 主要包括定位航行、空间探索、工作记忆等模式, 能反应长时、空间参考记忆能力。经过睡眠干扰14天后小鼠在水迷宫定位航行中的学习能力有所下降，表现为从第3天开始连续3天的寻台潜伏期均显著延长，而且在空间探索阶段中的穿台次数明显减少，表明模型小鼠的空间参考记忆能力显著下降。以上行为学分析结果显示，滚筒式睡眠干扰仪可诱导小鼠的学习记忆障碍。

睡眠干扰被认为会引起一些脑区的氧化应激反应, 进而导致认知功能损伤, 引起学习记忆障碍。大量的活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS）的产生能通过酶失活、脂质过氧化、DNA修饰等一系列变化造成神经元损伤, 进而最终导致认知功能障碍。机体为了防御这种应激损伤, 建立了一套完整的抗氧化酶防御自由基损伤系统, 如抗氧化酶SOD、GPX、过氧化物酶（catalase,CAT）和非酶类抗氧化物GSH等。总抗氧化能力（T-AOC）可以用来反应氧化应激水平, 而MDA则是脂质过氧化的产物, 被广泛认为是ROS引起损伤的生物标志物之一。鉴于脑内的皮层和海马在维持正常认知功能中的重要作用, 我们首先对小鼠该两个脑区内的T-AOC、SOD、MDA和GSH这四种氧化应激生物标志物的水平进行考察, 结果发现经过睡眠干扰14天后模型小鼠皮层和海马内的T-AOC、SOD和GSH活性均不同程度的显著下降, 而MDA水平则明显升高, 即模型小鼠脑内的氧化应激水平升高。除氧化应激之外, 近年来越来越多研究发现睡眠干扰导致的学习记忆障碍与引起机体炎性反应。睡眠干扰可显著升高促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）的水平, 炎性反应同样是神经退行性疾病的重要发病机制之一。

模型技术难点在于1-对滚筒内的动物频繁取出放回需要技巧，以保证可均衡性取出动物用于检测，从而避免动物长时间脱离睡眠干扰状态，产生功能性恢复；2-与其他应激方式不同，滚筒式睡眠干扰通过物理性剥夺动物的睡眠，模拟睡眠障碍效应，除整体动物行为学检测之外，可进一步结合电生理、组织病理学等深入探讨睡眠干扰对抑郁、焦虑、运动功能等影响，为全面防护睡眠干扰所致功能性损伤提供技术和模型储备。