STAT1基因敲除免疫缺陷小鼠模型

信号转到子和转录激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT）是络氨酸激酶（Janus kinase，JAK）-STAT信号传递途中的重要环节，通过这一途径细胞信号可以从细胞外传递到细胞内，使相关基因活化，实现对细胞生长、分化等技能的调控；包括7个成员。STAT1能够促进凋亡、移植细胞生长、分化，在抑制肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。

参考文献：

1.Targeted Disruption of the Mouse Stat1 Gene Results in Compromised Innate Immunity

to Viral Disease.

2. STAT1 inhibits liver fibrosis in mice by inhibiting stellate cell proliferation and stimulating NK cell cytotoxicity.

3. Accelerated Apoptosis of Lymphocytes by Augmented Induction of Bax in SSI-1 (STAT-Induced STAT Inhibitor-1) Deficient Mice.

4. STAT1 mediates the increased apoptosis and reduced chondrocyte proliferation in mice overexpressing FGF2.

5. STAT1-deficient mice spontaneously develop estrogen receptor α-positive luminal mammary carcinomas

6. Filovirus Infection of STAT-1 Knockout Mice.

7. Generation of mice with a conditionalStat1null allele.

1. 背景小鼠选择

背景小鼠C57BL/6J为近交系小鼠，是经过全基因组测序的小鼠，具有实验结果精度高、可比性好、应激反应均一等特点，是基因工程小鼠常用品系。本项目动物采用北京华阜康生物科技股份有限公司基础群SPF级C57BL/6J小鼠。饲养环境：SPF隔离器环境，温度22-24℃；相对湿度40-70%，co60照射小鼠繁殖料；高压灭菌水，动物自由采食和饮水。

2. 基因设计信息

2.1 靶基因位点选择

靶基因名称：信号转导及转录激活因子1基因Stat1 signal transducer and activator of transcription 1 [ Mus musculus (house mouse) ]

Gene ID: 20846

Also known as: AA408197; 2010005J02Rik

Location: 1 C1.1; 1 26.81 cM

Exon count: 26

Chromosome 1 - NC_000067.6

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/20846

mRNA: MMU06924; Protein: AAA19454. 749aa.

2.2 设计及构建质粒

利用CRISPR/Cas9技术，针对目的基因的插入位点寻找靶序列，根据靶序列信息设计针对该位点的guide RNA，经活性检测后，将具有活性的guide-RNA和Cas9体外转录成RNA，通过显微注射将guide-RNA，Cas9 mRNA和重组DNA注射到受精卵中，从后代中筛选获得基因定点插入的阳性小鼠。

3. 显微注射及胚胎移植

gRNA经体外合成、转录后与Cas9 RNA一起注射入C57BL/6小鼠受精卵细胞，受精卵细胞移植供体ICR小鼠。

4. F0代基因型鉴定

设计引物，PCR、DNA测序检测出生仔鼠基因序列，获得目标基因型STAT1基因敲除小鼠。

PCR扩增条件

5. F1代基因型鉴定

F0代小鼠与C57BL/6J小鼠杂交，获得F1代杂交小鼠，通过PCR及基因测序进行基因型鉴定。

小鼠通过限制性片段长度多态性（RFLP）对小鼠的基因型进行鉴定；通过Western blot方法使用STAT1的一抗蛋白对小鼠脾脏提取的蛋白样本检测；凝胶阻滞实验中使用STAT紧密结合的探针，对小鼠胚胎纤维母细胞检测STAT的激活情况。STAT1敲除小鼠和对照小鼠分别感染MHV病毒后，再通过组织切片观察肝脏病理改变情况；另外，感染5000fpu的水疱性口炎病毒（VSV），并观察小鼠的存活情况。

RFLP、WB和凝胶阻滞实验的实验结果：

STAT1和野生小鼠感染MHV后，肝脏病理改变情况：

可见STAT1-/-小鼠的肝细胞出现了坏死，并伴随大量巨细胞。

VSV感染后小鼠存活状态

STAT1敲除的小鼠对VSV感染更为易感，存活率明显下降。该小鼠胸腺有T/B细胞，基因不能被干扰素IFN-α和IFN-γ激活，更易受病毒感染。

动物模型的制备和应用实验必须在具备相应资质的实验室开展。动物模型的制备、应用过程中的监督管理、处置措施、对环境和生态影响等应符合国家相关法律规定。