自闭症家犬Shank3敲除模型

自闭症研究概况

美国精神科医师Kanner在1943年首次报道了11例自闭症病人。自闭症(autism spectrum disorder, ASD)存在于所有族群中，平均患病率约1%。自闭症是一类神经发育疾病，不同自闭症患者在自主生存能力、认知和语言能力以及并发症上存在巨大的表型异质性 (Lord et al., 2000)，主要有两大核心症状，即社会交流障碍和刻板重复性行为。这些症状在儿童早期出现并影响日常生活能力。自闭症影响到越来越多的家庭，带来巨大的经济负担和精神压力，已成为一个公共健康问题。因此我们需要积极寻找自闭症的致病原因，根据自闭症的致病基因构建动物模型，阐明自闭症的发病机制，为疾病的有效诊断和早期干预提供科学依据。

自闭症的致病原因仍有很多未知，多认为遗传因素起了主要作用，同时受环境因素影响。SHANK3是目前研究最深入的几个自闭症致病基因之一，该基因突变导致的病例约占自闭症总病例的1% (Jiang andEhlers, 2013)。含有SHANK3染色体区域的大片段缺失会导致22q13.3缺失综合症 (Phelan-McDermid Syndrome,PMS)(Wilson et al., 2003)。22q13.3缺失综合症病人缺失片段的大小可以从0.1 Mb到10 Mb不等 (Dharet al., 2010)，临床症状主要为肌肉张力减退、发育迟缓、语言缺失或滞后以及智力障碍，其中75%的病人也被诊断为自闭症 (Jiang and Ehlers, 2013)。上述SHANK3相关疾病是因为杂合突变造成的单倍剂量不足，SHANK3所在区域两倍或三倍重复增加的病例被诊断患有自闭症、注意缺陷多动障碍 (Attention-deficithyperactivity disorder, ADHD) 以及精神分裂症 (Failla et al., 2007; Moessneret al., 2007)，说明SHANK3剂量增加也会导致相关疾病。SHANK3基因的突变和横跨SHANK3区域的大片段重复都会引起一系列神经精神疾病，表明合适的SHANK3剂量对正常的大脑功能至关重要。

为了研究SHANK3突变的致病机制，研究者开发了不同动物模型。基因突变小鼠模型是研究人类SHANK3突变相关的疾病发病机理的主流途径，目前已开发出14种不同突变类型的小鼠品系 (Zhao et al., 2017)，但其表型由于突变位点的不同而各有差异。Shank3突变小鼠的研究提示，突触水平的缺陷是自闭症病理机制的核心。最早的Shank3基因突变小鼠缺失了编码ANK结构域的序列 (外显子4-9或4-7缺失) (Bozdagi et al., 2010; Peca et al.,2011; Wang et al., 2011)。对这些Shank3突变小鼠研究发现，海马体CA1神经元突触后功能和可塑性异常，小鼠社交行为减少，新生小鼠超声发声减少 (Bozdagi et al., 2010)。姜永辉教授实验室长期致力于开发Shank3小鼠突变体模型 (Wang, X. etal., 2016; Wang et al., 2011)，并在转录水平对Shank3基因进行了详细的分析 (Wang et al., 2014)。在缺失外显子4-9的Shank3纯合突变小鼠中，观察到异常社交行为，刻板重复行为以及异常的学习记忆，纹状体PSD组分中Homer1b/c、GKAP和GluA1的表达水平降低，而在海马未发现类似的变化 (Wang et al.,2011)。在缺失了外显子13-16 (编码PDZ结构域)的小鼠模型中，Shank3主要蛋白亚型缺失，突变体表现出重复理毛行为和社交缺陷 (Peca et al., 2011) 。

由于基因编辑技术在非人灵长类的成功应用，近年来猴也被用于研究自闭症的模型（Liu et al., 2016; Chen et al., 2017; Zhao et al., 2017）。由于猴的繁殖周期长，成本贵，表型检测相对困难，因此难以广泛用于疾病模型研究（Zhao et al., 2018），因而有必要开发新的的自闭症动物模型。

（1）狗的社交行为和脑区功能与人类类似

狗在3万3千年前左右开始在东亚的南部地区逐渐被人类驯化，驯化过程中最为显著的特点是行为的转变，特别是从惧怕人类到适应并相信人类 (Wang et al., 2013; Wang et al., 2016)。作为第一个被驯化的动物，狗在驯化过程中的心理已经变化，狗拥有狼所不具有的与人联系的方式 [1]。即使是小狗，也可以自发地对人类手势做出反应，例如指点线索，以找到隐藏的食物或玩具奖励，相比之下类人猿必须有丰富的经验才能表现出类似的技能[2]。宠物狗与工作犬相比有更强的社会依赖性，说明在狗的驯化过程中最重要的结果是狗倾向作为一个社会单元与人互动[3]。狗的面部表情的变化与主人是否注意有关，而与食物的刺激无关，说明狗在积极地与人类进行沟通[4]。2012年，Gregory S. Berns等训练了两只狗在没有镇静剂或物理限制的情况下采集高质量功能核磁共振（fMRI）图像 [5]。2013年他们将训练的犬数目扩大到13只，再次证实犬核磁共振是可行的 [6]。用同样的声乐和非声乐刺激人类和狗，发现狗对声音产生反应的脑区和人类的前颞语音相关的区域相似 [7]。这些狗的社会行为学研究和脑影像研究揭示了狗与人类脑功能对比研究对揭示人类认知、情感交流机制以及神经和精神疾病发病机理等具有重要的科学价值。

（2）家犬基因编辑与克隆技术进展

不同于小鼠、牛、羊等生物，狗一直被认为是世界上最难被克隆的动物之一，2005年，世界首例体细胞克隆犬“史努比”在韩国诞生(Lee et al., 2005)。2015年，中科院广州生物医药与健康研究院赖良学教授在世界上首次成功应用CRISPRs/Cas9系统对狗的Myostatin基因进行基因编辑，该基因编码肌肉生长抑制素 (Zou et al.,2015)。2018年, 冯冲等也利用此系统对ApoE基因进行编辑，成功得到纯合突变体, 而且对此基因编辑狗成功进行了克隆（Feng et al.,2018)。ApoE在脂质的运输和代谢中发挥主要作用，这一基因被敲除造成狗的血浆胆固醇升高，可能诱发动脉粥样硬化。我国在家犬基因编缉和克隆狗的构建方面走在世界前列。

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1、制备SHANK3基因敲除自闭症模型犬共需要实验用比格犬约100只，主要作为受精卵的供体和代孕母犬。实验犬的环境符合中华人民共和国国家标准GB14925-2001《实验动物环境及设施》要求。

2、制备SHANK3基因编辑模型犬，通过受精卵胞质注射完成。显微操作环境对空气的洁净度要求为10万级。用到的显微操作系统包括倒置荧光显微镜（Nikon, eclipse ti-u）和显微操作臂（nikon,NT-88-V3）。

3、制备SHANK3基因敲除模型，采用Cas9/CRISP基因编辑技术，主要的技术路线如下：判断母犬发情，进行配种，手术获得受精卵；通过显微注射将体外转录的cas9 mRNA和sgRNA同时注射到受精卵的胞质中；将注射过的受精卵移植到同期发情的代孕母犬的输卵管中；代孕母犬妊娠/分娩，得到F0代基因编辑犬；对F0代进行基因鉴定，筛选基因编辑阳性犬；通过繁育，获得SHANK3基因编辑杂合子和纯合子。

背景信息：

孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder, ASD)存在于所有族群中，平均患病率约1%。孤独症谱系障碍是一类神经发育疾病，不同孤独症患者在自主生存能力、认知和语言能力以及并发症上存在巨大的表型异质性 (Lord et al., 2000)，主要有两大核心症状，即社会交流障碍和刻板重复性行为。这些症状在儿童早期出现并影响日常生活能力。孤独症影响到越来越多的家庭，带来巨大的经济负担和精神压力，已成为一个公共健康问题。因此我们需要积极寻找孤独症的致病原因，根据孤独症的致病基因构建动物模型，阐明孤独症的发病机制，为疾病的有效诊断和早期干预提供科学依据。

基因信息：

SHANK3是目前研究最深入的几个孤独症致病基因之一，该基因突变导致的病例约占孤独症谱系障碍总病例的1%。含有SHANK3染色体区域的大片段缺失会导致22q13.3缺失综合症 (Phelan-McDermid Syndrome, PMS)。22q13.3缺失综合症病人缺失片段的大小可以从0.1 Mb到10 Mb不等，临床症状主要为肌肉张力减退、发育迟缓、语言缺失或滞后以及智力障碍，其中75%的病人也被诊断为孤独症谱系障碍。

通过对家犬的全基因组序列分析，发现在家犬中Shank3基因结构与小鼠和人类相似，全部具有22个外显子。 家犬Shank3基因第21号外显子编码一个富含脯氨酸的保守区域，该区域是孤独症患者发生突变的热点。因此，我们针对第21号外显子进行基因编辑（sgRNA 2和3），同时针对第5和第21号外显子两个位点（sgRNA 1和3）诱导Shank3的无效等位基因。目前公司拥有Shank3 21号外显子片段删除、5~21号外显子33Kb大片段删除的F0代以及不同基因类型的大量杂合F1代。

北京希诺谷生物科技有限公司具备实验动物使用许可资质SYXK（京）2016-0049，模型制备过程中不涉及病毒等生物活性物质。动物模型的制备、应用、处置均接受伦理委员会的监督。饲养及实验环境符合国家标准。相关设施运作过程中充分考虑防疫和人员保护要求。

病理体征：

1、孤独症合并症：

（1）运动能力：跑步机实验证明突变犬均存在不同程度的运动协调能力损伤，此外所有突变体都不能够爬楼梯，突变体均运动协调能力异常。

（2）活动与睡眠：通过活动监控仪实施24小时活动监测，发现Shank3突变犬夜间活动增加，睡眠碎片化；睡眠时间缩短，睡眠质量差。

2、孤独症核心症状：

（1）狗狗同类社交：

单箱实验：同类社交“单箱”实验结果显示：突变犬与陌生犬社交（嗅探、邀玩）时间明显减少，甚至出现夹尾、退缩等社交压力的表现，突变体在狗与狗社交能力方面存在缺陷。

（2）狗与人异类社交：

“求助”实验：突变犬与人的社交互动明显减少，在“困境”时无法及时的通过眼神交流向人类发出求助，社交依赖性比较弱，社交缺陷。

（3）刻板行为：突变体在没有皮肤炎症的情况下，自我抓挠、舔舐、刨笼子等行为明显增多，刻板行为明显。

Shank3基因编辑犬纯合F0代和杂合F1代在同类犬犬社交（经典的“三箱”实验）、异类犬人社交中均存在社交缺陷（社交时间减少、社交压力增加）、刻板重复性行为等孤独症核心症状；此外模型犬同样存在运动能力减弱、睡眠障碍等合并症状。以上表型较好的重复了临床孤独症患儿表型，是较为理想的孤独症研究的疾病动物模型。

创新性：

1、本项目为首次利用基因编辑技术构建神经精神疾病家犬模型。

2、与非人灵长类猴相比， 家犬的基因编辑技术成熟、成本低、繁殖发育快、便于表型分析。

3、家犬作为人类的伴侣动物，性情温顺，社交行为丰富，特别适用于社交与情感方向的研究。

4、本项研究既有利于解析社交与情感这一重大神经和认知科学难题，也有利于重大精神疾病的病理机制解析，推动临床转化。

应用价值：

一、 利用模型犬，开展相关课题研究，通过行为学表型、脑影像、分子检测分析，深入研究孤独症发病机制机理；

二、 利用模型犬，通过脑影像、分子检测分析，为孤独症客观诊断标准的制定提供依据；

三、 利用模型犬，开展相关药物有效性评价与新药研发实验：

1.评估药物对孤独症刻板行为的影响；

2.评估药物对社交障碍的影响；

3.评估药物对睡眠、运动能力、注意力障碍的改善；

四、利用模型犬，开展非药物治疗有效性实验与评价：

1.评估医疗器械、康复理疗仪器对孤独症的治疗效果；

2.评估外科手术、脑电干预对孤独症的治疗效果；

3.评估干细胞对孤独症的治疗效果；

4.评估社交训练等行为学教育对孤独症的治疗效果。