生长激素受体（GHR）基因敲除微型西藏小型猪

猪作为一种大动物模型，由于其器官大小、生理生化、解剖学和遗传学等特征与人类极其相似，且相比于灵长类动物更易饲养和操作，而被广泛应用于生物医药研究，如：（1）皮肤生理学和皮肤病或皮肤损伤的治疗[4-7]；（2）异种器官移植[8]；（3）生殖生理学；（4）神经系统病变及治疗[9, 10]；（5）代谢相关疾病等[11]。在国外，广泛应用的小型猪猪种主要有明尼苏达小型猪、汉福德（Hanford）小型猪 [11]、 尤卡坦（Yucatan）小型猪（美国）[13]和哥廷根（Gottingen）小型猪（德国）[14]等。明尼苏达猪是第一个小型猪品系，来源于几内亚野猪、皮纳森林野猪、卡塔利娜岛野猪和关岛野猪的杂交，体型相比于欧美家猪明显减少，性情温顺，便于使用；哥廷根小型猪来源于明尼苏达猪、越南小耳猪和长白猪的杂交，该品系小型猪繁殖性能好，性情温和，耐粗饲；尤卡坦由尤卡坦半岛野猪和中美野猪杂交选育而成，肤色呈浓茶色，被毛稀少或无被毛，性情温和，被广泛应用于皮肤等领域的研究。

目前，中国已经成功培育了多种小型猪品系，包括五指山小型猪[15]、贵州小型猪[16]、巴马小型猪[17]、版纳小型猪[18]和西藏小型猪[19]。西藏小型猪主要分布在西藏自治区及毗邻的四川、云南及甘肃等交通不便的半农半牧区。成年母猪体重平均为33.04kg，成年公猪体重约为25.9kg，是世界上分布海拔最高地区的品种第一，具有体型较小、性成熟早、耐粗饲、抗感染能力强和抗逆性好等优点，是我国有待开发的宝贵资源。南方医科大学实验动物中心自2004年8月引进西藏小型猪至今，已成功驯化，并广泛应用于动物疾病模型、转基因动物、器官移植等方面。但同时由于西藏小型猪具有体型较大、饲养成本高、保定困难等缺点，给实验研究带来些许不便。对小型猪体型缩小，即在确保器官功能不变但解剖结构按比例缩小，不仅可以降低饲养成本、研究成本、简化实验操作，另外对于构建SPF级小型猪也具有重大意义。

在动物生长调控中，GH-GHR-IGF1信号转导通路发挥着重要的调节作用（图1）。GH通过与靶细胞表面的GHR结合，促进IGF1的合成，进而发挥促生长作用。GHR基因位于猪的第16号染色体，包含有10个外显子，于各组织器官中广泛分布。成熟的GHR包括胞外结构域（生长激素结合域），跨膜结构域和胞内结构域。人和动物的侏儒症与GHR基因的突变具有密切的联系，不同结构域的突变，均可能会造成体型矮小[1-3]。

下丘脑根据机体需要分泌生长激素释放激素和生长抑素，以双重作用于垂体，控制生长激素（GH）的分泌。GH通过与GHR结合而作用于肝脏和其他器官，如肌肉组织、脂肪组织、软骨和骨组织等。作用分为IGF依赖性和IGF非依赖性模式。当GH与GHR结合时，GHR的胞内区二聚化，使得与GHR偶联的Janus kinase (JAK) 激酶相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化，JAK催化结合在受体上的STAT蛋白发生磷酸化修饰，活化的STATs蛋白以二聚体的形式进入细胞核内与靶基因结合，调控基因的转录 (e.g.IGF1,SOCS), 促进组织的生长和分化[20-22]。GHR的降解，JAK蛋白的去磷酸化和suppressors of cytokine signaling (SOCS) 蛋白的作用会抑制GH的作用[23-25]。在人基因突变数据库（Human Gene Mutation Database）人的侏儒表型和GHR突变有密切的关系[2, 3, 26]。

在经典的生长因子（growth factor）中IGFs (insulin-like growth factors; IGF1 and IGF2) 是促生长信号通路的主要成员。IGF2主要在正常胚胎发育中起作用，而IGF1在个体成长发育中起到连续的促生长作用。胰岛素样生长因子1 (IGF1)与胰岛素结构同源，主要通过GH刺激肝脏生成，通过内分泌，旁分泌和自分泌促进机体细胞的生长，特别是骨骼肌细胞，软骨，骨，肝脏，肾脏，神经，皮肤，造血细胞和肺脏。循环IGF1与IGFBPS结合蛋白(IGFBPs) 和酸不稳定性蛋白亚单位(ALS) 结合，而延长其半衰期并提高生物利用度。IGF1与其受体IGF1R结合后激活自身磷酸化并招募接头蛋白以促进细胞扩增、分化和组织功能。

本单位用CRISPR/Cas9基因编辑技术对西藏小型猪GHR进行靶向敲除，以期获得体型更加微小的西藏小型猪品系，为研究动物生长过程中GHR的作用提供更为理想的大动物模型，进而应用于莱伦氏综合征疾病的临床研究或作为一种体型更小的模式动物如SPF级微型猪进行推广应用。

3.1 实验材料 3.1.1 实验动物

动物品系：西藏小型猪；

等级：普通级；

1) 供受精卵用小型猪：西藏小型猪，雌性，6到8月龄，健康；

2) 种公猪：西藏小型猪，雄性，成年，生殖力强，健康；

3) 代孕母猪：西藏小型猪，雌性，12到18月龄，经产，健康。

出售单位：南方医科大学；

实验单位：南方医科大学；

伦理审查号：L2015087；

实验编号：00120370；

实验单位使用许可证编号：SYXK（粤）2011-0074；

许可证号：SCXK（粤）2011-0015。

3.1.2 试剂耗材

GHR抗体（Abcam ab202964）；

β-actin 抗体（Cell Signaling CST4970）；

PVDF膜 (Pierce公司)；

BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白上样缓冲液(5X)、化学发光检测试剂 (碧云天公司)；

蛋白 Marker （Fermentas公司）；

麦管（0.25 mL，法国，IMV）；

PZM-3培养液（需配制，表1）；

TCM-199操作液（需配制，表2）；

矿物油（M8410，美国，Sigma）；

胚胎水 (W1503，美国，Sigma)；

TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit（9762，日本，Takara）；

Age I限制性内切酶（R3552，美国，New England Biolabs）；

Bsa I限制性内切酶（R3535，美国，New England Biolabs）；

Phusion 超保真 DNA 聚合酶（M0530，美国，New England Biolabs）；

Premix Taq（R004A，日本，Takara）；

pMD19-T Vector Cloning Kit（6013，日本，Takara）；

MEGAshortscript T7 kit（AM1354，美国，Life Technologies）；

mMESSAGE mMACHINE T7 ultra kit（AM1345，美国，Life Technologies）；

Cas9表达载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9 （44758，美国，Addgene）；

sgRNA克隆载体pGL3-U6-gRNA-PGK-puromycin（51133，美国，Addgene）；

DNA抽提试剂（酚:氯仿:异戊醇=25:24:1，pH>7.8) (P1012，国产，北京索莱宝科技有限公司）;

RNA抽提试剂（酚:氯仿:异戊醇=25:24:1，pH<5.0）（P1011，中国，北京索莱宝科技有限公司）；

质粒小提试剂盒（DP103，中国，天根生化科技有限公司）；

血液/组织/细胞基因组提取试剂盒（DP304，中国，天根生化科技有限公司）；

四烯雌酮（CAS 850-52-2，国产，北京市科益丰生物技术发展有限公司）

Dubecco's磷酸缓冲液（P1002，国产，北京索莱宝科技有限公司）

青霉素钾（国产，成都中牧生物药业有限公司）

硫酸链霉素（国产，华北制药集团动物保健品有限责任公司）

手术切口无菌膜（海壳生，国产，上海海纯生物有限公司）

可吸收线（金环，国产，上海浦东金环医疗用品股份有限公司）

常用手术器械（金钟，国产，上海医疗器械有限公司手术器械厂）

宠物用留置针（海迪科，国产，山东海迪科医用制品有限公司）

毛细玻璃管（规格1.0×0.6×100 mm，国产，北京正天易科贸有限公司）

常用手术耗材（国产，纱布、棉签、棉球、碘酊、刀片等）

不同规格的培养皿、离心管、EP管、枪头等（美国，Corning）

3.1.3 主要仪器设备：

紫外透射仪（GL-312，国产，江苏海门市麒麟医用仪器厂）

电子分析天平（BT224S，国产，赛利多斯科学仪器有限公司）

电热恒温水浴锅（HWS12，国产，上海一恒科学仪器有限公司）

细菌恒温摇床（SPH-210A，国产，上海双旭电子有限公司）

洁净工作台（SW-OJ-2FD，国产，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）

生物安全台（HFsafe-1800，国产，上海力申科学仪器有限公司）

金属浴（TOMCS BG25，国产，杭州朗基科学仪器有限公司）

恒温热台（TP-CK05，日本，TOKAT HIT）

高速冷冻离心机（3K18，美国，Sigma）

PCR扩增仪（PTC 200，美国，Bio-Rad）

凝胶成像系统（GelDoc EQ，美国，Bio-Rad）

超低温冰箱（-80℃）（702，美国，Thermo）

紫外分光光度计（NanoDrop 2000，美国，Thermo）

高速离心机（Centrifuge 5418，德国，Eppendorf）

核酸蛋白测定仪（Biophotometer 6131，德国，Eppendorf）

电泳仪（DYY-2C，国产，北京市六一仪器厂）

生化培养箱（SPX-250B，国产，上海福玛实验设备有限公司）

高压蒸汽消毒器（HVE-50，日本，HIRAYAMA Manufacturing Corporation）

拉针仪（P-97，美国，SUTTER INSTRUMENT Company）

煅针仪（MF-900，日本，NARISHIGE Company）

体视显微镜（SZX10，日本，OLYMPUS）

显微注射显微镜（CKX41SF，日本，OLYMPUS）

显微操作仪（TransferMan NK2，德国，Eppendorf）

移液枪（各量程，德国，Eppendorf）

3.1.4 软件系统

SPSS统计分析软件（IBM SPSS 20.0）

3.1.5 试剂配制

（1）PZM-3培养液配制（表1）：

（2）TCM-199操作液配制：

3.2 实验方法 3.2.1 构建用于受精卵显微注射的sgRNA

3.2.1.1设计sgRNA

在ensemble网站查找猪的GHR基因，找到相应的外显子序列。将外显子序列输入CRISPR设计网站中进行分析，得到一系列相关的sgRNA序列，选择脱靶位点较少的一条sgRNA序列或者距离适中且脱靶位点较少的一对sgRNA序列作为靶位点。通过分析，得到以下敲除靶位点。

3.2.1.2.成对的寡核苷酸链的合成

对sgRNA（不包含PAM序列）的正反链分别加上可与经限制酶Bsa I线性化的pGU6粘性末端互补的接头，将重组序列发往广州睿博兴科生物技术有限公司进行合成（表4）。

3.2.1.3 成对寡核苷酸链的退火

按照以下反应体系加样，37℃反应30min后，将反应管置于装满水的1L是烧杯中，用微波炉加热至沸腾5min后，室温放置自然冷却至室温。得到的产物即为双链核苷酸链，用于之后的连接实验。

反应体系：

3.2.1.4 酶切线性化sgRNA骨架载体pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin( pGU6)

按以下反应体系用Bsa I对pGU6进行酶切，酶切产物为4927bp和25bp两个条带，用琼脂糖凝胶电泳进行验证酶切完全后，用胶回收试剂盒（天根DP209）对4927bp的条带胶回收，胶回收产物用于与上述双链核苷酸链的连接。

反应体系：

反应条件：37℃，2h后，4℃过夜。

注：此步骤的酶切是否完全直接影响到后续的连接反应。可取少量酶切产物进行再次酶切验证是否酶切完全。

3.2.1.5 sgRNA骨架载体pGU6与退火双链DNA连接

按照以下反应体系进行连接反应。16℃反应30min后，置于65℃水浴或金属浴10min灭活连接酶。

连接反应体系：

注：此反应体系中的10×T4 ligase reaction buffer含有ATP，故不可反复冻融。使用前应将其分装于小管中分次使用。连接产物可长期保存于-20℃。

3.2.1.6 获得 pGU6-sgRNA阳性克隆

取上述连接产物1-5μl加入到50μl DH5α感受态细胞中进行转化，将转化菌均匀涂布于氨苄抗性的琼脂平板上，于37℃恒温箱中培养12-16h后，挑取单克隆送往睿博兴科生物技术有限公司测序。对测序结果进行分析，筛选阳性pGU6-sgRNA单克隆。

3.2.1.7 PCR扩增获得sgRNA的体外转录模板并鉴定

按照以下反应体系和反应程序进行PCR扩增，每个反应体系为50μl，共10个反应体系，引物序列如下（表5）。PCR结束后将所有产物混合为一管产物，获得相当量的sgRNA体外转录的DNA模板。并用2%的琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

注：此PCR反应所用正向引物为T7启动子+sgRNA序列，加入T7启动子序列，以进行体外转录。反向引物与骨架载体pGU6上sgRNA scaffold的序列互补。此PCR反应必须使用高保真酶进行扩增，最大程度地保证产物的保真性。

3.2.1.8 纯化sgRNA的体外转录模板

1）向上述收集到的500μlPCR产物中加入等体积的RNA抽提试剂，混合均匀。

2）4℃，12000g离心5min。小心吸取上层清液到新的EP管中。注意不要吸到下层有机层。

3）加入1/10体积的3mM NaAC，混匀。加入上述总液体2倍体积的无水乙醇，混匀，-80℃放置至少1h（或过夜）。取出并4℃，12000g离心15min。

4）小心弃掉上清液，注意别打散沉淀。用70%乙醇洗涤沉淀2次，每次加400μl洗涤，洗涤后4℃，12000g离心5min。

5）用400μl无水乙醇洗涤，带走残留的盐溶液，吸尽液体，室温干燥5-10min使酒精挥发。

6）视沉淀大小加入适量胚胎水水溶解（10μl-20μl），测浓度。

3.2.1.9 sgRNA的体外转录，转录后纯化及鉴定

用MEGAshortscript™ Kit（life Technology,A1354）体外转录试剂盒按如下反应体系进行sgRNA的体外转录。反应条件为37℃，4h。体外转录结束后，于每个反应体系中加DNase（1.5μl），37℃反应20min，去除DNA模板。反应结束后，加入480μl Nuclease-free Water，用苯酚氯仿抽提法进行纯化（同sgRNA体外转录模板的纯化），视沉淀大小加适量胚胎水溶解RNA沉淀，使浓度不低于500ng/μl，并分装于 200μl PCR管中。纯化后的RNA用2%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。

反应体系：

注：（1）体外转录和纯化所有操作必须在超净台中进行，所使用的所有枪头、EP管及试剂须严格控制RNA酶的污染。（2）电泳鉴定的琼脂糖凝胶和电泳缓冲液均须新鲜配置，以减少RNA酶的作用。

3.2.2 构建用于受精卵显微注射的Cas9 mRNA

3.2.2.1 线性化Cas9载体

按以下反应体系用限制性内切酶AgeI 对Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9酶切线性化，37℃酶切过夜。反应结束后进行琼脂糖电泳鉴定是否酶切完全。大小为9317bp的线性化产物用作Cas9的体外转录模板。

反应体系：

3.2.2.2 纯化Cas9 mRNA的体外转录模板

1）将50 μl的Cas9载体酶切产物收集到新的1.5mlEP管中，加入胚胎水到500μl总体积。加入等体积的苯酚氯仿异丙醇混合液，上下颠倒混匀20s后，于16000g离心5min。小心吸取上层水相至新的EP管中。

2）加入1/10体积的3mM醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀后放置于-80℃至少1h（或过夜）。取出后，于4℃，16000g离心30min,至管底出现沉淀。如未出现沉淀，再加适量3mM醋酸钠混匀置于-80℃冰箱至少1h后再次离心。

3）小心去除上清，加入200μl 70%乙醇洗涤，16000g离心1min，弃掉洗涤液。此步骤共重复3次。

4）加入400μl无水乙醇洗涤沉淀，带走残留的盐溶液。吸尽洗涤液，室温放置5-10min晾干，挥发尽乙醇。

5）加适量无RNA酶的胚胎水溶解，用作体外转录的模板。

3.2.2.3 Cas9 mRNA的体外转录

3.2.2.4 Cas9 mRNA的体外转录及鉴定

（1）于冰盒中放置解冻mMessage mMachineT7 Ultra Kit ( Ambion )试剂盒中相关试剂，按如下反应体系加样。于37℃体外转录反应4h。加入2μlDNase，37℃反应15min去除模板DNA。

反应体系：

（2）Cas9 mRNA末端添加polyA序列

体外转录后的产物添加polyA序列可增强mRNA的稳定性和反应效率。按如下反应体系加样进行加polyA的反应，37℃，30-45min，反应后立即置于冰上。

Cas9 mRNA加polyA的反应体系：

3.2.2.5 Cas9 mRNA的纯化

1）将上述体外转录产物（即Cas9 mRNA）收集到新的1.5mlEP管中，加入胚胎水到500μl总体积。加入等体积的苯酚氯仿异丙醇混合液，上下颠倒混匀20s后，于16000g离心5min。小心吸取上层水相至新的EP管中。

2）加入1/10体积的3mM醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀后放置于-80℃至少1h（或过夜）。取出后，于4℃，16000g离心30min,至管底出现沉淀。如未出现沉淀，再加适量3mM醋酸钠混匀置于-80℃冰箱至少1h后再次离心。

3）小心去除上清，加入200μl70%乙醇洗涤，16000g离心1min，弃掉洗涤液。此步骤共重复3次。

4）加入400μl无水乙醇洗涤沉淀，带走残留的盐溶液。吸尽洗涤液，室温放置5-10min晾干，挥发尽乙醇。

5）加适量无RNA酶的胚胎水溶解，调整浓度为1000ng/μl以上。

6）吸取1μl用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。高质量的Cas9 mRNA电泳条带应清晰无拖尾，且大小约为4300bp。

注意：（1）体外转录和纯化所有操作必须在超净台中进行，所使用的所有枪头、EP管及试剂须严格控制RNA酶的污染。（2）电泳鉴定的琼脂糖凝胶和电泳缓冲液均须新鲜配置，以减少RNA酶的作用。

3.2.3西藏小型猪受精卵的采集

3.2.3.1 供卵母猪的准备：同期发情

供卵母猪选择6-8月龄的健康雌性西藏小型猪，21头分三个圈饲养在单独的实验场地，连续饲喂四烯雌酮共18天后停药诱导同步发情。

母猪的发情周期一般为18-21天，发情期持续2-3天。发情一般分为：发情前期、发情中期和发情后期。发情前期表现为采食量下降，烦躁，阴门开始红肿，但不接受爬跨；发情中期表现为具有静立反射，阴门外周呈现深红色，排出较多粘液，阴门褶皱明显增多，接受公猪爬跨；发情后期表现为静立反射消失，阴门逐渐恢复正常，拒绝公猪爬跨。

停四烯雌酮6日左右，对母猪查情。查情方法赶公猪进入集体饲养的母猪圈舍，观察并记录接受公猪爬跨的母猪耳号。待发情母猪与公猪配种后，接受交配的母猪次日再次查情后，处在发情后期的母猪可手术取卵，仍在发情中期的母猪需延后3到4h取卵。

3.2.3.2 受精卵采集

1)术前准备：取卵手术前一天，准备手术器械、手术衣、铺巾等手术用品，并高温高压灭菌，烘干备用。手术室须开启紫外灯灭菌20-30分钟后，方可使用。供卵母猪手术前12小时需禁食，以减轻麻醉药品对消化道的刺激。打开水浴锅调至38.5℃，放入生理盐水、冲卵用DPBS进行保温备用。

2)母猪的麻醉：麻醉方法用速眠新II和异氟烷气体麻联合麻醉的方法、，首先用速眠新II按0.1ml/kg体重肌肉注射进行麻醉，待动物四肢无力、无法行走的时候，将猪固定，给母猪带上连接了氧气麻醉面罩，打开气体麻醉机，先将麻醉剂浓度调至5%，观察母猪状态，直到母猪睫毛、角膜反应迟钝，肌肉松弛，皮肤夹捏反应减弱或消失后，将气麻药浓度调至1-2%，将其抬到手术台进行保定，术中时刻监护母猪呼吸状态，若呼吸出现异常，及时调整气麻浓度，防止因呼吸骤停导致母猪死亡。

3)手术部位消毒：用宠物专用剃毛刀剃除母猪下腹部皮肤上的毛发，用吹风机将残留的短发吹掉，避免毛发对伤口的污染。用碘酒消毒下腹部皮肤，然后用酒精脱碘，待皮肤干燥后于手术部位贴无菌手术贴膜。

4)开腹：从下腹部倒数第二个乳头，沿腹中线（或距离乳头大约3cm左右的两侧）切开一个5cm左右的切口，用刀柄或大的止血钳小心钝性分离切口两侧的脂肪（尽量避开肌肉，不破坏肌肉层结构），当腹膜露出时，用钝头剪刀剪开腹膜。用手探入腹腔，找到子宫角，将子宫慢慢牵引出腹腔，顺势找到卵巢，将卵巢和连着的子宫，撕开囊膜暴露卵巢，检查卵巢的排卵状况，观察排卵点的数量，预估排卵数。用浸有38.5℃生理盐水的纱布给卵巢和子宫保温保湿。

5)冲卵：剪取无菌输液器细管端，管口须平整光滑，以便于从输卵管伞部插入输卵管，而不损伤输卵管内壁。用手将输卵管和细管固定，管的另一端放置一个干净的平皿来收集冲卵液。在输卵管的另一端连接的子宫角处用动脉夹或者止血钳夹住，在输卵管一侧用留置针小心扎入输卵管内部，拔掉留置针的金属针部分，留塑料的针鞘部分在输卵管内，轻轻向前推，如通畅无阻力，则说明插入成功；如推不动阻力大，则须在其下游重新扎入、插管。25ml注射器内装满38.5℃预热的DPBS作为冲卵液，从留置针的一端缓缓注入，将输卵管内的受精卵冲出，收集好的冲卵液放在带有热台的体视显微镜下，用口吸管捡取受精卵。此过程要注意控制流速，观察输卵管的膨胀程度，不宜膨胀过大，否则会造成损伤。对另一侧卵巢做同样的处理。将取到的受精卵用口吸管吸到一个无菌的直径3.5cm培养皿的猪卵母细胞操作液液滴中（液滴用矿物油覆盖，放于热台上保温）。将采集到的受精卵保温运回实验室，重新置于覆盖有石蜡油的PZM3培养液液滴中，置于CO2细胞培养箱内，38.5℃培养，于30min后即可进行受精卵显微注射。

6)缝合：冲卵完成后，用38.5℃预热的生理盐水冲洗输卵管和创口，将卵巢重新用输卵管伞包住，将卵巢和子宫重新还纳于腹腔，尽量放还原位。然后逐步缝合创口处的腹膜、筋膜、脂肪层和皮肤层。缝合完成后的创口手术部位涂抹紫药水（毒性小，对组织无刺激，且能与坏死组织凝结成保护膜，起收敛作用）杀菌预防感染。

7)术后护理：手术完成后的母猪单笼饲养，连续三天注射青链霉素消炎，手术当天仅喂水不喂食，术后第二天开始赶母猪站起活动，并饲喂拌水的软料。术后7-10天母猪伤口基本恢复，可以赶至圈舍与其他猪一起饲养，并准备进入下一期的饲喂四烯雌酮诱导同步发情。

3.2.4 显微注射

3.2.4.1 受精卵的准备

取上述手术冲卵法得到的受精卵用新的猪卵母细胞操作液中洗3次，用猪卵母细胞操作液做20μl的覆盖石蜡油的液滴，将洗好的受精卵放入准备显微注射操作。

3.2.4.2 注射物质的配制

将每条sgRNA和Cas9 mRNA用胚胎级别的无RNA酶水稀释到500ng/μl，然后配制成10ul体系的注射混合物，配方为(10ul)：

将混合物混匀，放置于冰上，用于显微注射。

3.2.4.3 受精卵胞质内显微注射

1 制作持卵针、注射针，将Cas 9 mRNA和sgRNA的混合物吸入注射针，将注射针和持卵针装载至显微操作仪上。

2 将放卵的TCM-199培养皿滴置于载物台上，移动注射针和持卵针到与受精卵同一水平面。

3 用持卵针吸取受精卵使其固定，调整注射针的位置，使其与持卵针尖端处于同一水平面，操作注射针穿过透明带和细胞膜进入细胞质，看到细胞质由膨胀后，撤出注射针。

4 注射完毕后，将受精卵用用平衡好的PZM3培养液滴洗涤3次后，置于新的平衡好的PZM3液滴中于38.5℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中进行短暂培养。

3.2.5 胚胎移植

在供卵母猪交配当天或者取卵手术当天，从猪群中挑选处于发情中期的经产母猪作为代孕母猪，胚胎移植手术可以安排在取卵手术的当天或次日，采用与3.3.2中一样的方法对代孕母猪进行麻醉、保定和消毒。从下腹部倒数第二个乳头，沿腹中线（或距离乳头大约3cm左右的两侧）切开一个5cm左右的切口，用刀柄或大的止血钳小心钝性分离切口两侧的脂肪（尽量避开肌肉，不破坏肌肉层结构），当腹膜露出时，用钝头剪刀剪开腹膜。用手探入腹腔，找到子宫角，将子宫慢慢牵引出腹腔，顺势找到卵巢，将卵巢和连着的子宫，撕开囊膜暴露卵巢，检查卵巢的排卵状况，如未排卵，须用无菌针头将卵泡扎破刺激。从输卵管伞部找到输卵管的入口，将显微注射后的基因修饰胚胎吸入胚胎移植管中，沿输卵管入口插入输卵管，用手将输卵管捋直使胚胎移植管插入到输卵管第2个自然弯曲处，吹入胚胎。然后将胚胎移植管缓缓退出，用输卵管伞部包裹好卵巢，将卵巢和子宫还纳于腹腔，关闭腹腔。代孕母猪在手术后一直单圈饲养，注意观察其是否返情，如果返情则证明胚胎移植失败，如果无返情，在术后20-30天用猪早孕诊断试纸（北京万华生物）检测是否怀孕，对怀孕的代孕母猪加强营养，定期检查母猪状态。如有条件可定期用B超监测胎儿发育情况，直至仔猪的出生。

4.1 评价与验证方法

观察获得的子代西藏小型猪的生长情况，并提取F0代西藏小型猪DNA，通过对猪GHR打靶位点进行测序分析，来确定出生的西藏小型猪是否出现了靶位点的基因敲除。

4.1.1 仔猪基因组DNA提取

仔猪出生3周后，用酒精棉球擦拭耳缘，用灭菌的剪刀剪取少量耳组织，用DNA提取试剂盒提取仔猪DNA。

4.1.2 PCR扩增仔猪GHR基因2号外显子

根据西藏小型猪GHR基因序列，设计相应引物（表6）PCR扩增西藏小型猪GHR基因2号外显子，对PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定并胶回收目的条带，送样测序公司使用正向或反向引物进行测序，将测序为单峰的序列结果在NCBI-BLAST网站与野生型参考序列进行比对，将测序结果为套峰的猪相应PCR产物进行TA克隆，再使用各自的正向引物进行测序，将测序结果在NCBI-BLAST网站与参考序列进行比对，获得具体的碱基插入、缺失、置换情况。

表6 检测西藏小型猪GHR基因敲除情况的引物

PCR反应体系（20 ml）：

4.1.3 脱靶分析

可能的脱靶位点检测选择错配少于5bp的外显子区域。脱靶位点预测可在CRISPR设计网页（http://crispr.mit.edu/）寻找。脱靶位点检测选择错配少于5bp的外显子区域。脱靶序列和引物序列见表7,表8。对PCR产物进行Sanger测序分析结果未检测到脱靶效应。

表7 预测的脱靶位点表

表8 PCR扩增脱靶位点的引物序列

4.1.4 生长曲线

对每只小猪每月测一次体重和体高，体长，作生长曲线。

4.2 结果 4.2.1 F0代西藏小型猪的基因型分析

诱导3头西藏小型猪母猪同期发情并与种公猪静地交配后，共得20个受精卵（其中10个为2细胞期）。SgRNA-sGHR-1与Cas 9 mRNA显微共注射获取的受精卵后，移植1头西藏小型猪代孕母猪。妊娠114天后生产4只仔猪（2只雄性，2只雌性）。初生时4只小猪体型没有差别。1月龄时剪取耳组织和尾组织提取基因组，对sgRNA位点进行TA克隆和Sanger测序分析（见图2）。结果显示所获得的4只仔猪中，2只为杂合突变型（编号为#1, #2），分别为#2（雄性）发生了22bp缺失的突变，#3（雌性）发生了17bp的插入突变。其余2只（编号为WT雌性；#3,雌性）为野生型（红色字体部分为sgRNA序列位点）。

4.2.2 F0代西藏小型猪的生长曲线

对每只小猪每月测一次体重、体高和体长。杂合缺陷型相比于野生型体重、体高和体长偏小。

4.2.3F0代西藏小型猪基因表达检测

对其耳组织和尾组织提取RNA，逆转录，对GHR和下游基因IGF1进行q-PCR分析。结果相比于#1，#2和#3的GHR及其下游基因IGF-1的mRNA均有下调，并具有统计学差异（图4，A；*:P<0.05; **:P<0.01）。同时对耳组织和尾组织提取蛋白，进行Western blot分析。结果显示#2和#3个体GHR表达下调。

4.2.4 F0代西藏小型猪相关激素和血糖检测

分别抽取F0代猪血清，用化学发光的方法检测血清中IGF1和胰岛素（insulin）的水平，用血糖试纸检测血糖水平。取同年龄野生型的西藏小型猪做对照。结果如下（图5，A-C）。GHR突变个体与野生型相比，血清中IGF1水平下降，且有统计学意义，P<0.05；而胰岛素水平和血糖水平无差异。

4.2.5 GHR脱靶效应检测

与20bp的sgRNA和NGG（PAM,3bp）有15bp以上匹配的外显子位置的基因序列均视为可能的脱靶位点。所有潜在的脱靶位点经PCR扩增后进行Sanger测序并于野生型基因组比对。结果显示所有检测的脱靶位点均无突变发生。

4.2.6 纯合GHR敲除西藏小型猪的获取

将获得的F0代杂合GHR敲除西藏小型猪#2和#3号交配后获得一只F1代纯合的GHR敲除雄性西藏小型猪。体尺指标见图7，A-C。纯合GHR敲除西藏小型猪体长、体重、体高与GHR杂合、野生型西藏小型猪比较。

图7 纯合GHR敲除西藏小型猪体尺指标

A：体长曲线；B：体重曲线；C：身高曲线。

4.3 评价指标体系

生长激素受体基因(GHR)敲除西藏小型猪是通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除GHR基因而获得的，没有插入任何外源基因，为非转基因动物。获得的微型西藏小型猪由于是通过受精卵胞质注射法而制备的，不携带异种品系猪的线粒体DNA——母系遗传物质，能保持品系的纯正。所用的受精卵均通过手术体内冲卵获得，没有到屠宰场采集卵巢和卵母细胞，生物安全可控。GHR突变引起的为隐性性状，可通过藏猪之间交配繁殖保种，得到的后代均为微型西藏小型猪，能稳定遗传。微型藏猪在普通实验饲养环境能正常繁殖存活，生物安全性高。

猪拥有和人更接近的解剖学，生理学特性。在人类疾病动物模型、新药安全性有效性评价、异种器官移植供体等领域均显示出独特优势。虽然小型猪体型较小，但是体重仍在40KG-50KG上下，在实验操作、微生物控制、饲养成本控制等方面仍然会造成诸多的不便，所以制作出比小型猪更为微小的微型猪有着更为重要的意义。

本单位通利用CRISPR/Cas9受精卵注射法获得了GHR基因敲除微型西藏小型猪。该方法可有效避免了体细胞核移植法所引起的胚胎发育延迟、出生后存活率低、同一细胞克隆株所获得的性别单一等问题。此外，受精卵由胞质内注射法所获得的F0代并不携带外源猪种的线粒体DNA，很好地保留了西藏小型猪的其他特性。

GHR敲除西藏小型猪主要是模拟人的一型莱伦氏综合征（Laron syndrome），也称生长激素迟钝侯群，是常染色阴性侏儒症遗传病。一型莱伦氏综合征在临床上主要特点是生长激素受体基因（GHR）受损或突变导致生长激素作用受阻碍，导致患者生长迟缓，身材矮小。纯合GHR敲除的西藏小型猪不存在野生型GHR等位基因，微型个体间交配繁殖只能生出微型个体，育种相对方便。目前已通过GHR敲除的杂合F0代间交配繁殖目前已获得了1只纯合GHR敲除小型猪。1岁龄的纯合GHR敲除西藏小型猪体重仅为15.1Kg，而正常1岁龄西藏小型猪体重为31±5.96kg。纯合GHR敲除的小型猪体尺指标正常的西藏小型猪对比发生明显的缩小，但头部大小未见异常和一型莱伦氏综合征极为相似。

纯合GHR敲除的西藏小型猪与普通西藏小型猪的各体尺指标之间存在明显的差异，纯合GHR敲除的西藏小猪生长发育速度在六个月出现后明显停滞，体重、体长较普通西藏小型猪有明显的缩小。通过分析和比较纯合GHR敲除的西藏小型猪与普通西藏小型猪的繁殖性能指标，发现它们的繁殖性能相似，说明纯合GHR敲除的西藏小型猪在普通饲养环境下能正常繁殖，不受GHR基因失活的影响。

实验结果表明，GHR基因功能失活的西藏小型猪除发育迟缓、体尺指标与同龄普通西藏小型猪相比明显下降，繁殖性能指标、血液生理和生化指标等与普通西藏小型猪的对应指标基本保持一致。纯合GHR基因敲除西藏小型猪能在普通级动物饲养环境下很好地存活和繁殖。纯合GHR基因敲除西藏小型猪体型小，有着易于实验操作、微生物控制和低饲养成本的优点，且其还保存着西藏小型猪的生物学优势，是SPF实验用猪的新选择，同时也可以作为一型莱伦氏综合征的重要疾病模型，为侏儒症的治疗，药物开发提供帮助。因此，我们认为GHR基因敲除西藏小型猪适合用作实验小型猪新品系，满足科研实验需求。