抑郁症c57小鼠慢性社会挫败应激模型

抑郁症是一种慢性、易复发的精神情志障碍性疾病，其典型特征表现为消极沉闷、思维迟缓、快感缺乏、无价值感及罪恶感，严重者甚至产生自杀的念头。据世界卫生组织报道，抑郁症已成为首要致残原因，20多年抑郁症将成为导致疾病负担的一个重大因素[1, 2]。目前抑郁症的治疗以药物治疗为主。而对于抗抑郁药物的研究涉及到分子水平、组织、器官和整体动物等多个方面，其中动物与人类在进化上的高度保守性，利用实验动物在不同层次的行为响应特征与人类相比具有的相似性，而且可以避免直接以人体为对象进行研究产生的极大风险及受到的伦理学制约，抑郁动物模型已成为抗抑郁药物研发的必要手段[3, 4]。

社会挫败应激模型是一种社会性心理应激的抑郁模型，以动物间的从属关系为基础的社会应激方式，是一种心理应激模型[5]。它通过同种动物相同或不同品系个体间的个体斗争后，引起挫败动物产生情绪和心理压力，从而导致其产生抑郁行为，CSDS具有良好的建构效度、表面效度和预测效度，对于抑郁症的病理生理研究和抗抑郁药物筛选有重要意义[6,7]。研究表明，长时间的慢性社会挫败应激刺激后，动物会出现一系列的抑郁样症状包括社会回避行为、快感缺失、行为绝望等，且抗抑郁药物能逆转这些改变[8, 9]。采用社会挫败应激刺激建立更好地模拟人类抑郁症的发生方式的抑郁动物模型很有必要。研究表明，进行社会挫败应激的天数不同，其导致的症状也不相同。现有的造模方法和造模时间均没有统一的标准，因此，本研究在前期实验研究和文献调研的基础上，选用不同造模周期（1天、7天、14天、28天）通过社会交互实验、糖水偏爱实验、新奇抑制摄食实验、悬尾实验和强迫游泳实验等行为学评价方法，比较不同社会挫败造模周期的抑郁行为学改变，以期为抑郁症的研究提供标准化、操作性强的慢性社会挫败模型模型。同时，我们选用氟西汀作为阳性药研究了模型的预测效度。

参考文献：

[1]Malhi G S, Mann J J. Depression[J]. Lancet, 2018,392(10161):2299-2312.

[2]Mcdonnell C. The burden of depression[J]. Nature,2014, 515(7526):163.

[3]Ito N, Hirose E, Ishida T, et al. Kososan, aKampo medicine, prevents a social avoidance behavior and attenuatesneuroinflammation in socially defeated mice[J]. Journal of Neuroinflammation,2017, 14(1):98.

[4]Hao Y, Ge H, Sun M, Gao Y. Selecting anAppropriate Animal Model of Depression[J]. International Journal of MolecularSciences. 2019, 20(19):4827.

[5]桂舒佳,田绍文,谢明.社会挫败应激模型的研究进展[J].社区医学杂志,2015,13(24):81-83.

[6]Golden S A, Covington H E, Berton O, et al. Astandardized protocol for repeated social defeat stress in mice[J]. NatureProtocols, 2011, 6(8):1183-1191.

[7]Frijtag J C V, Reijmers L G J E, Harst J E V D,et al. Defeat followed by individual housing results in long-term impairedreward- and cognition-related behaviours in rats[J]. Behavioural Brain Research,2000, 117(1):137-146.

[8]Jiang B, Wang F, Yang S, et al. SKF83959 ProducesAntidepressant Effects in a Chronic Social Defeat Stress Model of Depressionthrough BDNF-TrkB Pathway[J]. International Journal of Neuropsychopharmacology,2014, 18(6):pyu096.

[9]Jiang N, Lv J W, Wang H X, et al.Antidepressant-like effects of 20(S)-protopanaxadiol in a mouse model ofchronic social defeat stress and the related mechanisms[J]. Phytotherapyresearch, 2019, 33(10):2726-2736.

（1）动物：SPF级C57BL/6J小鼠（20~22g），雄性，6-8周龄；SPF级CD1小鼠（35~40g），雄性6-8月龄

（2）材料：定制的透明亚克力隔板

（3）仪器：小鼠恒温游泳仪（KSQT6），小鼠悬尾仪（KSXS01）(均由北京鑫海华仪公司、中国航天员科研训练中心和中国医学科学院药用植物研究所联合研制)

（4）模型诱导方法：

① 筛选CD-1作为攻击鼠

在社会挫败应激之前，对雄性120退役CD-1小鼠(18-20周龄)的攻击行为进行筛选以确保入侵小鼠的受打击力度。评价CD-1小鼠的攻击行为有两个标准: 每只CD1小鼠连续攻击C57小鼠至少2天，观察周期为180秒，筛选期为3天;第一次攻击在60秒以内[15]。最终筛选合格的54只CD-1小鼠选择作为攻击鼠在实验前在挫败笼子中习惯性喂养两周。

② 慢性社会挫败应激

造模开始后每天将C57小鼠作为“入侵者”放入居住有筛选合格的攻击鼠（CD1小鼠）的饲养笼内，允许它们身体接触5分钟[26, 27]。在它们接触的过程中，C57小鼠会受到CD1小鼠间歇性的攻击，表现出躲避、恐惧、顺从等行为。5分钟的身体接触后，立即使用多孔的透明有机亚克力板（厚4mm）将二者隔开饲养于同一饲养笼内共24小时，在这 24小时里C57小鼠与CD1小时无身体接触，但可以从视觉、嗅觉、听觉上感知CD1小鼠从而接受对它的心理刺激。24小时后，将C57小鼠取出放入住有另一新的攻击鼠的饲养笼里重复之前操作，保证每天C57小鼠接受不同的攻击鼠的应激，应激持续28天。正常组C57小鼠使用同样的饲养笼，与另一C57小鼠成对饲养，用多孔的透明有机亚克力板将二者隔开，每天更换不同的居住对象且保证无身体接触。在反复的社会挫败应激过程中，若挫败鼠出现伤口超过1厘米的情况下，将小鼠从研究中移除并立即安乐死。本实验中4周社会挫败应激造模，之后进行行为学检测。

1材料

（1)试剂：

盐酸氟西汀片，批号：20190516，常州四药制药有限公司。

乙腈（色谱纯），美国Merck 公司；

甲醇（色谱纯），美国Merck 公司；

甲酸铵（分析纯），北京化工厂；

去甲肾上腺素（NE）标准品，中国药品生物制品检定所；

5-羟色胺（5-HT）标准品，美国Sigma 公司；

多巴胺（DA）标准品，美国Sigma 公司；

3,4-二羟基苄胺（DHBA）内标，美国Sigma 公司；

异丙醇（分析纯） 北京化学试剂公司

无水乙醇（分析纯） 北京化学试剂公司

氯仿（分析纯） 北京化学试剂公司

甲醛（分析纯） 北京化学试剂公司

无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司

二甲苯，国药集团化学试剂有限公司

甲苯胺蓝染色试剂，武汉谷歌生物科技有限公司

中性树胶，国药集团化学试剂有限公司

EDTA抗原修复液, 武汉赛维尔生物科技有限公司

柠檬酸 抗原修复液, 武汉赛维尔生物科技有限公司

Doublecortin antibody (Ab77450)，英国Abcam公司

Anti-NeuN antibody (Ab177487), 英国Abcam公司

Fluorescein isothiocyanate-labelled horseanti-rabbit IgG, 美国Pierce公司

Rhodamine-labelled goat anti-mouse IgG, 美国Pierce公司

PBS缓冲液, 北京中杉金桥生物技术有限公司

Tween-20，美国Amresco公司

Protein Ladder, 赛默飞

BDNF antibody (Ab108319)，英国Abcam公司

Doublecortin antibody (Ab77450)，英国Abcam公司

Anti-NeuN antibody (Ab177487), 英国Abcam公司

CREB antibody (#9197), 美国Cell Signaling Technology (CST)公司

Phospho-CREB antibody (#9198), 美国Cell Signaling Technology (CST)公司

p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody (#9107), 美国Cell Signaling Technology (CST)公司

Phospho- p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody (#4370), 美国Cell Signaling Technology (CST)公司

β-ACTIN antibody (#4967), 美国CellSignaling Technology (CST)公司

HRP-linked goat anti rabbit IgG antibody (#7074), 美国Cell Signaling Technology (CST)公司

HRP-linked goat anti mouse IgG antibody (#7076), 美国Cell Signaling Technology (CST)公司

总蛋白定量测定试剂盒（BCA法）, 南京建成生物工程研究所

小鼠血清皮质酮（CORT）试剂盒，中国南京建成生物工程研究所

（2）仪器：

Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司

AL104电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司

1200型液相色谱系统，美国Agilent公司

Q-Trap5500型质谱分析仪，美国应用生物技术公司

Infinite M1000全波长多功能酶标仪，瑞士Tecan公司

2720型PCR仪 美国ABI公司

system electrophoresis Mupid（Mupid 2plus）电泳槽 日本TAKARA公司

image system(EUV-LDUV)凝胶成像系统 韩国KoreaBiotech公司

centrifuge（MICRO 17TR）离心机 韩国Hanil公司

超净工作台 苏州净化公司

2.5µl/10µl/100µl/200µl/1000µl移液器 德国Eppendorf公司

Eppendorf epMotion 5070 自动加样项目合作单位 德国Eppendorf公司

autoclave（LS-B50L）灭菌器 中国江阴滨江公司

Freezer Big（DW-40L262）冰箱 青岛海尔公司

mixer vortex（Voltex-Genie2 ）漩涡混合器 美国SI公司

脱水机，武汉俊杰电子有限公司

包埋机，武汉俊杰电子有限公司

病理切片机，上海徕卡仪器有限公司

冻台，武汉俊杰电子有限公司

组织摊片机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司

烤箱，上海慧泰仪器制造有限公司

载玻片及盖玻片，江苏世泰实验器材有限公司

正置光学显微镜，日本尼康

成像系统，日本尼康

2 评价方法

2.1 行为学实验

1) 社会交互实验

在最后一次社会挫败应激刺激的24h内进行社会交互实验[28]。社会交互实验设备包括方形白色亚克力塑料测试箱 (40×40×40cm), 穿孔透明亚克力塑料盒（7×10×40 cm）及录像设备。实验前将透明塑胶盒置于测试箱一侧中央位置。社会交互实验包括两个阶段分别为没有交互对象的适应期和有交互对象的检测期，每个阶段150s，两个阶段间隔30s内。在适应期内，将每只测试的C57小鼠背向塑料盒轻轻放入测试箱中央，开始第一阶段的检测，允许其自由探索150 s。适应期结束后立即把检测小鼠从测试箱中拿出，放回其原来的饲养笼中。然后将一只攻击鼠放入透明塑料盒里，接着将测试鼠再次背对塑料盒重新放入测试箱中央，开始第二阶段，并允许它再次探索150秒。摄像机记录了C57BL/6小鼠在适应期和检测期间在交互区（定义为塑料盒周围宽8cm的U形区域）停留的时间。每次实验结束后，用75%消毒酒精擦拭测试箱和塑料盒，避免气味对实验的影响。

2) 糖水偏爱实验

糖水偏爱实验分为训练期及测试期[29]。训练期共两天，所有动物单笼饲养，给予每只小鼠两瓶液体：一瓶蔗糖糖水 (1%) +一瓶纯水，训练期期间动物自由饮食饮水，期间每个12小时更换水瓶位置，保持实验环境安静。训练期次日9:00 am，将食物和水瓶取出，动物禁食（不禁水）共8 h。下午17:00 pm，进行糖水偏爱实验测试，每只小鼠自由饮用提前称好重量的糖水和纯水共16h。次日早上9:00 am，取下糖水瓶和纯水瓶称重。根据动物糖水、纯水摄入量计算动物的糖水偏爱指数（糖水偏爱指数 = 糖水消耗/总液体消耗 × 100%）。测试结束后，加食加水，所有动物自由饮食饮水。

3) 新奇摄食抑制实验

在动物禁食(不禁水)24h后进行新奇抑制实验检测[30]，检测前预先在测试箱（方形、黑色）中心放入一颗饲料（保证每次实验每颗饲料大小相等），然后将小鼠背对饲料放入测试箱的一角即开始实验，时间检测时间为5min。保证每次从同一方向将动物放入同一位置。观察记录动物自放入笼中至首次摄取食物的时间(即摄食潜伏期)，以动物开始咬食饲料为摄食标准。

4) 小鼠悬尾实验

将小鼠尾巴距尾尖部约1cm 处缠上胶布，通过与S性小铁钩与悬尾箱支架上的传感器相连,小鼠呈倒悬体位, 其头部离悬尾箱底面约5cm。总的悬挂时间为6min, 统计小鼠后4min内悬尾累积不动时间（不动状态即小鼠停止挣扎不动或无任何活动）。

5) 小鼠强迫游泳实验

将小鼠分别放入水深15cm的小鼠恒温游泳仪（高20cm，直径14cm）中，水温维持在24±1℃。测试总共6min, 前2min适应期结束后，计算机自动记录小鼠后4min内游泳累积不动时间。

2.2 血清皮质酮水平的测定

以生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定小鼠血清中皮质酮（CORT）含量，按照试剂盒的操作步骤进行，于450nm波长测定吸光度（OD）值，制作标准曲线，其含量单位分别是：pg/mL，ng/L，ng/mL

2.3 小鼠模型单胺类神经递质的影响

2.3.1 脑组织样品处理

UFLC-MS/MS检测前从-80℃冰箱中取出冰冻的海马组织，称重，并记录质量，加入100 µL的超纯水，冰浴中超声匀浆得海马匀浆液。精密吸取50 µL组织匀浆液，加入100 µL 4℃乙腈（含内标DHBA 5 µg/mL），涡旋混匀后置于-80℃冰箱过夜。次日取出匀浆液于4℃低温离心（2×104 rpm，30 min），取上清液转入样品瓶中进行神经递质浓度分析。

2.3.2 色谱条件

检测采用TSK Gel amide 80（2.0mm×150mm，3µm）色谱柱,柱温35℃，流动相为乙腈-15mM甲酸铵水溶液（pH 5.5）（40:60）,流速0.4 mL/min。

2.3.3 质谱条件

检测采用美国应用生物技术公司（AB SCIEX）的Q-Trap 5500型质谱分析仪，以电喷雾电离方式进行离子化，以多反应检测（MRM）模式进行扫描，离子源及其他相关参数优化为：TEM: 500 oC； CAD: Medium； Gas1: 50 psi； Gas2: 70 psi； CUR: 20 psi。

+MRM模式参数为：喷雾电压5500 V; EP: 10; CXP: 10;

2.3.4 标准液的配制精密称定5-HT、DA和NE的标准品各2 mg装入试管中，分别加入80%甲醇（含0.2%甲酸）配制成1 mg/mL的储备液，放于-80℃冰箱备用。精密称取DHBA 2mg，用80%甲醇（含0.2%甲酸）配制成1 mg/mL的内标（IS）储备液，存于-80℃冰箱备用。实验前，取各储备液适量，混匀后，以80%甲醇（含0.2%甲酸）稀释成系列混合标准液，其中5-HT、DA、E、NE和DOPAC的浓度分别为200，100，1，0.2 ng/ml。2.3.5 标准曲线检测前，吸取各混合标准品溶液各50 µL，加入含内标DHBA （5 µg/mL）的乙腈溶液100 µL，涡旋混匀，然后精密吸取5 µL溶液装入进样小瓶（含内衬）放入UFLC-MS/MS进行分析。分别以各神经递质的浓度作为横坐标，质峰面积与内标的峰面积比值作为纵坐标，通过软件进行线性回归，最后绘制出对应的神经递质的标准曲线。2.4 SY对CSDS小鼠模型海马海马神经发生的影响免疫荧光（Neun+DCX）（1）石蜡包埋切片：将大鼠脑片进行常规石蜡包埋，把切好的脑片置于载玻片上。（2）脱蜡：a.脱蜡：二甲苯或松节油(Ⅰ)作用5～15min→二甲苯或松节油（Ⅱ）作用5～10min。b.清洗：无水乙醇处理1～2min→95%乙醇处理1～2min→80%乙醇处理1～2min→70%乙醇处理1～2min→水洗、蒸馏水洗0.5～2min。（3）抗原修复：EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）倒进修复盒中装满后将组织切片小心浸入修复缓冲液中，然后放入微波炉中进行抗原修复15分钟（中火加热7～8min→停止加热7～10min→中低火加热7～8min，需保证组织切片不能太干。取出组织切片，自然冷却后用PBS（PH7.4）清洗3次，每次5min。（4）画圈自发荧光淬灭：组化笔在脑组织周围画圈，然后在圈内加入自发荧光淬灭剂（5min～7min），水洗、用流水冲洗（8min～10min）。（5）封闭:在圈内滴加40uL的BSA，室温条件下，孵育（25min～30min）。（6）抗体反应：小心的在脑切片上滴加一定量的一抗（预先用PBS按一定比例配好）。然后将加好一抗的脑切片平放在湿盒内，放入4°C冰箱中过夜。第二天将玻片从冰箱中取出，吸出一抗后将组织切片放入PBS中洗涤3次，每次5min～10min。小心的再圈内滴加二抗使其覆盖组织，然后室温条件下孵育50min，此过程应在避光条件下进行。（7）DAPI复染细胞核：组织切片置于PBS洗涤3次，每次5min。在圈内滴加DAPI染液，室温条件下，孵育10min，此过程应在避光条件下进行。（8）封片：再次用 PBS洗组织切片（每次5min～10min，洗3次）加入抗荧光淬灭封片剂封片。（9）拍照、观察。2.5 SY对CSDS小鼠模型BDNF信号通路的影响2.5.1 蛋白抽提预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂（cocktail）；12000rpm（4度）离心15min。取上清，进行蛋白定量。2.5.2 蛋白质浓度测定（BCA蛋白质定量试剂盒）按照试剂盒使用说明操作，测定蛋白浓度。1. 按照50:1比例配制BCA工作液。2. 完全溶解蛋白标准品，浓度为2mg/ml。3. 加入按照不同浓度的的标准品至20μl。4. 加入等体积配置好的样本。5. 每个检测孔分别加入200μl的50:1比例配制而成的工作液，设置温度37℃，放置30分钟。6. 将酶标仪调整到562 nm波长处，然后测OD值。7. 通过标准曲线计算出蛋白浓度。4.1.6.3 WB实验（一）SDS-PAGE电泳1. 配备10％分离凝胶，加入TEMED胶灌胶，并用异丙醇密封。2. 等至胶凝充分凝固后倒去胶上层异丙醇，吸干（吸水纸）。3. 配制浓缩胶（4.8％）后灌胶（加入 TEMED），在上层空间灌入浓缩胶使用梳子插入浓缩胶中。4. 计算样本品所需量，并与5×loading buffer充分混匀，沸水煮5min后立即速冷。5. 根据蛋白定量的结果，第1孔加入marker蛋白，其它每孔加入20 ul已变性蛋白，进行电泳。在电压80 V下进行浓缩胶电泳，120V电压下分离胶电泳。当蛋白marker条带分开清晰时即终止。（二）转膜1. 根据蛋白marker指示，分别切胶，CREB，P-CREB，AKT（70-75 KD），pAKT，ERK1/2，P- ERK1/2,β-actin。2. 将NC膜浸湿后与滤纸共同放入转膜缓冲液中浸透。3. 将滤纸，膜，胶按照顺序放好（未观察到气泡）。4. 盖上仪器，接通电源，转膜300 mA，AKT、pAKT约2 h，CREB、P-CREB、β-actin 约1 h。5. 转膜后，将膜取出放入TBST中清洗5 min。6. 使用丽春红染膜测转膜效率。（三）封闭配制5%脱脂奶粉，将转膜浸入脱脂奶粉后静置1.5h。（四）一抗孵育按照说明将一抗按比例稀释，一抗孵育后放入冰箱调温度至4度过夜。

（五）二抗孵育次日，洗膜三次后，用TBST稀释HRP标记的二抗，其中小鼠抗（M）和兔抗（R）稀释液为1： 5000和1：6000， 稀释后，将第二抗体与膜一起温育90分钟。（六）显色/曝光采用化学发光检测（ECL、SuperSignal）采用检测法，首先将ECL化学发光液与膜共同孵育3分钟，在吸尽液体后用保鲜膜将膜包裹杂交膜，最后再暗盒内曝

光15 min显影冲洗。Western blot结果以AKT、pAKT、CREB、pCREB与β-action条带灰度值的相对比值记录。3 评价结果① 慢性社会挫败应激对小鼠行为学的影响 实验中，社会交互实验结果显示CSDS造模7天、14天、21天和28天后模型小鼠在交互区的时间与正常对照组相比显著减少，动物表现出明显的社会回避行为；而阳性药氟西汀给药14天、21天和28天可以逆转CSDS引起的社会回避行为。提示CSDS造模7天后动物出现明显的社会回避行为，氟西汀给药14天后可改善其社会回避行为。在糖水偏爱实验中，与空白组相比，CSDS造模7天和14天动物的糖水消耗量并没有明显改变，在造模21天和28天时，模型组动物的糖水偏爱指

数为较正常组相比显著降低；与模型组相比，阳性药氟西汀给药21天后可以显著增加动物糖水偏爱指数，给药28天极显著增加动物的糖水偏爱指数。提示，CSDS造模21天和28天可引起动物的快感缺失的抑郁样症状，且氟西汀给药可逆转这一抑郁样行为。新奇摄食抑制实验结果显示，与空白组比较，CSDS造模14天、21天和28天后，挫败小鼠摄食潜伏期显著增加；与模型组相比，阳性药氟西汀给药21天和28天可以显著减少CSDS引起的摄食潜伏期的增加。提示CSDS造模14天后动物表现出明显的冲突矛盾的抑郁焦虑样行为，而氟西汀给药21天后可改善这种抑郁焦虑行为。悬尾实验和强迫游泳实验结果显示，与空白组比较，CSDS造模21天后，挫败小鼠在TST和FST中，其均不动时间显著增加，CSDS造模21天后，模型小鼠在TST和FST中，其不动时间极显著增加；与模型组相比，阳性药氟西汀给药21天和28天可以显著逆转CSDS引起小鼠在TST和FST不动时间的改变。提示CSDS造模21天和28天动物表现出明显的抑郁样症状-行为绝望，而氟西汀给药

21天和28天可改善这种抑郁样表现。

4.2.2 慢性社会挫败应激28天对小鼠血清皮质酮水平的影响

② 慢性社会挫败应激28天对小鼠脑内单胺类神经递质和的影响

③ 慢性社会挫败应激28天对小鼠海马神经发生的影响

④ 慢性社会挫败应激28天对小鼠海马区BDNF-ERK -CREB信号通路的影响

实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

应激是导致抑郁症发生的重要原因之一。通常，诱发人类抑郁症的生理心理发生变化应激源属于社会性应激[1]。研究表明，长时间的慢性应激刺激后，动物会出现一系列的抑郁样症状包括社会回避行为、快感缺失、行为绝望等，且抗抑郁药物能逆转这些改变。本实验中，结果表明，在造模7天后动物出现明显的社会回避行为，造模14天模型组出现对焦虑冲突行为，造模21天后动物出现明显的行为绝望并表现出快感缺失症状，造模28天后动物快感缺失症状及其显著。造模28天后，在社会交互实验、糖水偏爱实验、新奇抑制摄食实验、悬尾和强迫游泳实验中均表现出持续、稳定、最明显的抑郁样行为改变，因此建议选择CSDS造模28天进行药效学实验为宜。

目前，抑郁症的发病机制尚未完全清楚。单胺神经递质假说是抑郁症发病机制中最重要的假说之一[2]。该假说认为抑郁症是由于大脑某些区域单胺类神经递质水平异常引起的。临床上应用的大多数一线抗抑郁药，如三环类抗抑郁药( TCAs) 、5-羟色胺重摄取抑制剂（SSRI）等，也正是通过抑制突触前膜单胺类递质再摄取，升高突触间隙单胺类神经递质水平而发挥抗抑郁作用[3]。本实验中，结果显示CSDS抑郁模型动物海马和皮层中5-HT、NE和DA含量显著降低，表明CSDS抑郁模型的发生机制与单胺类神经递质有关。

下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴是一个重要的内分泌轴参与与抑郁症的发生发展。研究表明，慢性应激会激活并损伤HPA轴功能从而诱发抑郁症，下丘脑分泌促肾上腺皮质激素释放因子，调节腺垂体分泌促肾上腺皮质激素，最终引起CORT分泌过量，进而引起机体损伤[4]。临床研究表明，抑郁症患者血浆和脑脊液CORT含量显著升高[5, 6]。本研究发现，CSDS模型小鼠血清CORT较正常组明显升高，与文献报道一致。

海马神经发生是指神经干细胞增殖分化迁移整合入神经回路中生成具有功能的神经元，整合进入原有海马神经网络系统可影响海马的功能，在抑郁症的发生发展中起着重要的作用[7-9]。DCX( doublecortin，微管结合蛋白)，是神经元前体细胞标志蛋白，常常用来反映神经发生。成人大脑中，DCX+细胞表达局限于神经发生的两个脑区和新生未成熟神经元的迁移区，因此可以用来研究新生神经元的分化、迁移，是比较常用的研究神经发生的标志蛋白[10]。本实验结果表明，CSDS模型组小鼠NueN + DCX标记的阳性细胞明显降低，表明模型组小鼠海马区神经元增生受到抑制，提示CSDS能抑制了海马神经再生与文献报道一致。

研究表明抑郁症患者和抑郁症模型动物海马中的BDNF表达水平下调 [11]。而多种抗抑郁药物（如五羟色胺再摄取抑制剂及三环类抗抑郁药物）均能逆转BDNF表达的降低同时明显改善神经元损伤[12, 13]。本实验结果显示，与空白组相比CSDS模型组小鼠海马的BDNF表达水平显著降低。此外，本实验中CSDS模型小鼠海马组织中BDNF信号通路相关蛋白CREB、ERK1/2的磷酸化水平较对照组明显降低，这与文献报道结果也是一致的。

综上所述，慢性社会挫败28天能后模型小鼠出现快感缺失，社会回避、行为绝望等抑郁样行为，且其血清皮质酮水平和海马和前额皮层5-HT、NE、DA 水平显著降低；海马神经发生抑制； BDNF及的表达及下游pCREB, p-AKT,和p-CREB的表达水平明显减少。本研究结果显示社会挫败应激28天建立了稳定小鼠抑郁症动物模型，且模型表现出良好的表观、结构及预测效度。

不同于其他物理应激模型， CSDS是以动物间的从属关系为基础的社会应激方式，是一种心理应激模型。它通过同种动物相同或不同品系个体间的个体斗争后，引起挫败动物产生情绪和心理压力，从而导致其产生抑郁行为，可以很好的模拟人类在生活中遭受社会心理压力所致的抑郁症。CSDS具有良好的建构效度、表面效度和预测效度，对于抑郁症的病理生理研究和抗抑郁药物筛选有重要意义。

技术难点：慢性社会挫败应激时动物可能在造模过程中产生物理性伤害，从而影响实验结果，建议在物理伤口大于一厘米是将该动物进行安乐处死。并筛选合适的攻击CD-1 小鼠。

参考文献：

[1] 彭云丽,王雯英,蒋春雷,王云霞.应激诱发抑郁症的细胞因子机制研究进展[J].生理学报,2013,65(02):229-236

[2] López-Muñoz F, Alamo C. MonoaminergicNeurotransmission: The History of the Discovery of Antidepressants from 1950sUntil Today[J]. Current Pharmaceutical Design, 2009, 15(14):1563-1586.

[3]Fournier J C, Derubeis R J,Hollon S D, et al. Antidepressant Drug Effects and Depression Severity: APatient-Level Meta-Analysis[J]. Journal of the American Medical Association,2010, 303(1):47-53.

[4] 柴丽,赵博.抑郁症与HPA轴关系及中药干预的研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(12):268-271.

[5]Yang X H, Song S Q, Xu Y.Resveratrol ameliorates chronic unpredictable mild stress-induceddepression-like behavior: involvement of the HPA axis, inflammatory markers,BDNF, and Wnt/β-catenin pathway in rats[J]. Neuropsychiatric Disease andTreatment, 2017, 13:2727-2736.

[6]Gu L, Liu Y J, Wang Y B, et al.Role for monoaminergic systems in the antidepressant-like effect of ethanolextracts from Hemerocallis citrina[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2012,139(3):780–787.

[7]Abehiguchi N, Uchida S,Yamagata H, et al. Hippocampal Sirtuin 1 Signaling Mediates Depression-likeBehavior[J]. Biological Psychiatry, 2016, 80(11):815-826.

[8]Sahay A, Hen R. Adulthippocampal neurogenesis in depression[J]. Nature Neuroscience, 2007,10(9):1110-1115.

[9]Park S C. Neurogenesis andantidepressant action[J]. Cell & Tissue Research, 2019, 377(1):95-106.

[10] Couillard-Despres S, Winner B,Schaubeck S, et al. Doublecortin expression in adult brain reflectneurogenesis[J]. European Journal of Neuroscience, 2005, 21(1):1-14.

[11] Deyama S , Bang E , Kato T , etal. Neurotrophic and Antidepressant Actions of Brain-Derived NeurotrophicFactor Require Vascular Endothelial Growth Factor[J]. Biological Psychiatry,2019, 86(2):143-152.

[12] Duman R S, Aghajanian G K,Sanacora G, et al. Synaptic plasticity and depression: new insights from stressand rapid-acting antidepressants[J]. Nature Medicine, 2016, 22(3):238-249.

[13] Mostert J P, Koch M W, HeeringsM, et al. Therapeutic Potential of Fluoxetine in Neurological Disorders[J]. CNSNeuroscience & Therapeutics, 2008, 14(2):153-164.