颞叶癫痫小鼠海人酸模型

研究目的及意义

癫痫是最常见的神经系统疾病之一，据估计，全世界范围内约有5000万癫痫患者，每年的癫痫发生率约为240万。我国目前约有900万的癫痫患者，约占全世界癫痫患者总数的1/5[1-4].

部分性癫痫患者约占癫痫患者总数的60%，部分性癫痫是指癫痫的病灶位于大脑半球中的一个或者位于一侧大脑半球的局部区域内[4]。颞叶癫痫是部分性癫痫的常见类型。颞叶癫痫患者中约有1/3的患者对于常见的抗癫痫药物治疗无效，这使得颞叶癫痫成了成人最难治疗的癫痫类型。对于这些患者，手术切除治疗是唯一的治疗选择。颞叶癫痫手术治疗前需要准确定位致癫组织，手术切除时更需要完整切除致癫灶。但是由于致癫组织切除不足，仍有30%左右患者出现癫痫复发。对于无法准确定位致癫组织的癫痫患者来说，手术切除并不适合他们[1, 5]。

综上，颞叶癫痫实验动物模型可以为颞叶癫痫的组织病理学研究和临床治疗提供帮助。其中受到广泛使用的就是颞叶癫痫小鼠海人酸模型。

海人酸（kainic acid, KA）是L-谷氨酸的环状类似物以及离子型KA受体激动剂，最早从海藻中提取，当作杀虫剂使用。KA处理神经元可以诱导强烈的去极化作用最终导致神经元的死亡，这也是颞叶癫痫主要的病理表现[6]。KA处理的啮齿类动物最开始具有急性期癫痫发作，随后进入4-5周的潜伏期，最终进入难治性的自发性癫痫发作阶段。KA处理的啮齿类动物会有海马硬化相关的病理表现，包括海马神经元丢失，颗粒细胞散布，苔状纤维发芽等，这与颞叶癫痫患者的病理表现接近[6]。

使用颞叶癫痫小鼠海人酸模型可以很好地模拟颞叶癫痫患者地临床表现，为颞叶癫痫发病机制的研究以及抗颞叶癫痫药物的研发提供帮助。

国内外研究进展

Nadler等人第一批报道KA对海马神经元有影响。这些实验表明，在Sprague-Dawley大鼠脑室内注射KA（0.5 nmol）1-3天后导致海马吻端CA3区锥体细胞变性，而高剂量（0.8μg）则导致海马尾更多区域的神经元丢失[6]。高于0.8μg的剂量可以导致海马CA1和CA2区域神经元变性。Ben-Ari等人的研究中发现杏仁核内注射KA能够引起海马神经退行性病变和癫痫发作行为。Cepeda等报道在狒狒杏仁核内注射KA可引起双侧海马损伤和癫痫持续状态（status epilepticus ,SE）。上述研究表明杏仁核和海马内注射KA可以再现颞叶癫痫患者脑组织相关病理变化，这种动物模型可以代表颞叶癫痫模型[6]。

实验材料

8-10周龄雄性C57BL/6小鼠，1ng/nl KA工作液，5%水合氯醛溶液，3% H2O2，75%医用酒精，医用消毒棉签，手术器械，手术缝合线，小动物立体定位注射仪，医用小动物打孔器，一次性医用注射器，微量注射玻璃针。

实验环境

屏障环境，无菌操作台。

实验方法

1. 小鼠麻醉，一次性医用注射器腹腔注射200 ul 5%水合氯醛（小鼠体重按照20g算），小鼠深度麻醉后（颞叶轻轻夹脚趾无反应，呼吸均匀）转移到小动物立体定位注射仪上，固定头部。

2. 用眼科剪剪去小鼠头部毛发，暴露头皮，75%医用酒精消毒皮肤，用消毒后的镊子从中缝位置夹起头皮，眼科剪沿中缝靠右2 mm处剪开10 mm左右的创口，暴露颅骨。

3. 用医用棉签蘸取3% H2O2，轻轻擦拭颅骨表面组织；医用棉签蘸取75%医用酒精擦去残留的H2O2，医用棉签擦净颅骨表面。

4. 医用小动物打孔器按照坐标 AP=2.0 mm，ML=1.8 mm打孔，打孔后用医用棉签蘸取75%医用酒精擦去骨粉。

5. 小动物立体定位注射仪安装好微量注射玻璃针后抽取200 nl KA，按照坐标AP=2.0 mm，ML=1.8 mm，DV=2.3 mm进针，接下来开始注射，注射速度 200 nl/min。注射完成后停针2 min。2 min后收回微量注射玻璃针。

6. 使用手术缝合线缝合小鼠头顶伤口，消毒伤口附近皮肤。注射结束后的小鼠放在舒适恒温的环境中使其自然苏醒，小鼠苏醒后放回原来的笼位中，及时补充食物和饮水。

1. KA注射后的急性癫痫发作

KA注射后5 min小鼠开始有轻微癫痫发作，如面部胡须抽动，逐渐发作为全身性的强直-阵挛性癫痫发作，进入癫痫发作急性期[6]。小鼠表现出前后肢抽搐，弓背等行为。急性期癫痫发作大概持续1-3个小时后可自行恢复。

2. 病理验证

颞叶癫痫小鼠模型在KA注射4周后，取小鼠大脑做病理切片和免疫组化染色，可见单侧海马出现如下的改变：（1）CA1-CA3区锥体神经元出现广泛的死亡（苏木素染色或DAPI染色可见核固缩现象）；（2）GFAP染色可见KA注射测海马有明显的反应性星形胶质细胞增生；（3）苏木素染色可见海马齿状回颗粒细胞出现明显的散布。如果不具备此类病理改变，则建模失败。

3. 脑电图验证

KA注射后4周后小鼠进入慢性期癫痫发作，具有稳定的自发性癫痫发作。在此阶段在小鼠头部埋置脑电记录电极，通过EEG脑电记录，记录癫痫发作情况评估建模效果[7, 8]。一般来说，建模成功的小鼠在脑电记录上表现出明显的癫痫尖波放电，每只小鼠大概每周有3次以上的自发性癫痫发作。同步视频记录可以观察到在脑电出现同步化异常放电时，小鼠出现明显的前后肢抽搐行为。如果不具备异常脑电和癫痫发作行为，则建模失败。

4. 公开发表的论文依据

本模型的建立工作发表论文：何婷婷等.构建海人酸诱导的内侧颞叶癫痫小鼠模型.基础医学与临床.2011;31(7):820-824.

应用本模型筛选得到Hsp90抑制剂17AAG可用于治疗颞叶癫痫小鼠的癫痫发作，研究结果发表于知名实验医学期刊：Sha LZ, et al. Pharmacologic Inhibition of Hsp90 to Prevent GLT-1Degradation as an Effective Therapy for Epilepsy. Journal of ExperimentalMedicine. 2017;214(2):547-563.

动物模型制备所用野生型C57BL/6小鼠均具有检疫合格证明。

通过EEG脑电记录的方法评估颞叶癫痫小鼠KA模型建模效果。建模成功的小鼠具有比较频繁的自发性癫痫发作，根据建模效果和注射位置的不同，小鼠癫痫发作情况和病理表现也有略微的不同。

颞叶癫痫小鼠KA模型是一种被广泛应用在颞叶癫痫疾病研究中的动物模型，大量的研究表明，颞叶癫痫小鼠模型可以在一定水平上模拟人类颞叶癫痫患者地疾病进程，有助于颞叶癫痫发病机制地研究以及抗癫痫化合物地筛选。在颞叶癫痫小鼠KA模型建立过程中，最关键的主要有两点：第一，保证KA在有效期内；第二，注射位点位于海马CA区。

创新性：

本模型与以往的基于电点燃或化学点燃的模型不同，通过单侧海马注射海人酸的颞叶癫痫小鼠模型，其致癫灶仅仅局限在一侧海马内。造模成功后，单侧海马形成典型的海马硬化病理改变。这一模型能在最大程度上模拟颞叶癫痫患者的单侧海马病变，并且具备起源于海马的自发性癫痫放电和癫痫发作的表现，是一种良好的筛选治疗难治性颞叶癫痫的小鼠模型。