SARS-CoV-2感染Ad5-hACE2转导的非转基因小鼠模型

1、目的及意义：

快速构建用于COVID-19致病机制研究、疫苗和药物评估的小鼠模型。该模型构建周期短（2-3周），不需要特殊繁育，可用于多种基因修饰小鼠动物模型构建；且技术方法简单，易于重复，适宜大规模推广，有利于我国抗病毒药物、抗体、疫苗的应急验证及致病机制研究。

2、国内外研究进展：

动物模型对于致病机制的研究，疫苗和抗病毒药物的评估是必需的。目前可支持SARS-CoV-2复制的动物模型有非人灵长类动物 [1-3]、转基因小鼠[4]、雪貂 [5,6]等。灵长类动物与人亲缘关系最近，但是由于不易获得、费用昂贵、难以操作限制了其应用。小鼠由于容易获得、遗传背景清楚、易于操作，是最理想的小动物，被广泛用于人冠状病毒致病机制研究 [7]。

野生型小鼠不支持SARS-CoV-2的复制，ACE2是SARS-CoV-2的受体[8]，最先报道的动物模型是秦川团队构建的hACE2转基因小鼠[4]，以105 TCID50病毒感染6-11月大的hACE2转基因小鼠，除了体重减轻5%外，没有观察到其它临床症状。在感染后3天和5天，在肺部检测到了病毒RNA。同时从小鼠肺中成功分离出病毒，在电子显微镜下观察到病毒粒子。肺右叶背部可见病灶损伤，典型的组织病理是间质性肺炎，细支气管和血管周围有显著的炎症细胞浸润。病毒抗原可在支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞检测到。此小鼠模型繁殖周期较慢，病毒复制较弱，并且局限于单一遗传背景。

另一个hACE2转基因小鼠由石正丽团队[9]报道 ，与秦川团队构建的hACE2转基因小鼠不同的是，hACE2的表达由肺纤毛上皮细胞特异性HFH4/FOXJ1启动子控制，被称作HFH4-hACE2转基因小鼠，主要在肺部高表达hACE2，在其它组织如脑、肝、肾、肠道的表达水平不同。HFH4-hACE2转基因小鼠以往被用于SARS-CoV和蝙蝠 SARSr-CoVs致病机制研究。此小鼠模型产生与COVID-19病人相似的典型间质性肺炎和病理变化，病毒主要在肺脏中复制，在某些小鼠的眼部、心脏、脑部检测到病毒RNA，肺部和脑部分离得到的病毒基因序列一致。最后研究者证明预先暴露SARS-CoV-2可以保护小鼠免受重症肺炎。SARS-CoV-2对不用性别的HFH4-hACE2小鼠易感性不同，可引起致死性脑炎，不能反映SARS-CoV-2感染人后的致病机制，限制了其应用。

Benjamin Israelow等人[10]利用腺相关病毒载体转导表达人源ACE2构建SARS-CoV-2易感小鼠模型，此模型支持病毒的复制和抗体的产生，病理表现与COVID-19患者和非人灵长类动物一致。研究者发现I型干扰素不能控制病毒复制，反而导致病理反应。此小鼠模型的优点是快速，也可用于多种基因修饰小鼠动物模型构建，但是病毒复制能力不强。

参考文献：

[1] Deng W, Bao L,Liu J, et al. Primary exposure to SARS-CoV-2 protects against reinfection inrhesus macaques[J]. Science, 2020.

[2] Munster V J, Feldmann F, Williamson B N, et al. Respiratory diseasein rhesus macaques inoculated with SARS-CoV-2[J]. Nature, 2020.

[3] Rockx B, Kuiken T, Herfst S, et al. Comparative pathogenesis ofCOVID-19, MERS, and SARS in a nonhuman primate model[J]. Science, 2020,368(6494): 1012-1015.

[4] Bao L, Deng W, Huang B, et al. The pathogenicity of SARS-CoV-2 inhACE2 transgenic mice[J]. Nature, 2020.

[5] Shi J, Wen Z, Zhong G, et al. Susceptibility of ferrets, cats, dogs,and other domesticated animals to SARS-coronavirus 2[J]. Science, 2020, 368(6494):1016-1020.

[6] Kim Y I, Kim S G, Kim S M, et al. Infection and Rapid Transmissionof SARS-CoV-2 in Ferrets[J]. Cell Host Microbe, 2020, 27(5): 704-709 e2.

[7] Cockrell A S, Leist S R, Douglas M G, et al. Modeling pathogenesisof emergent and pre-emergent human coronaviruses in mice[J]. Mamm Genome, 2018,29(7-8): 367-383.

[8] Zhou P, Yang X L, Wang X G, et al. A pneumonia outbreak associatedwith a new coronavirus of probable bat origin[J]. Nature, 2020, 579(7798):270-273.

[9] Jiang R D, Liu M Q, Chen Y, et al. Pathogenesis of SARS-CoV-2 inTransgenic Mice Expressing Human Angiotensin-Converting Enzyme 2[J]. Cell,2020.

[10] Israelow B, Song E, Mao T, et al. Mouse model of SARS-CoV-2 revealsinflammatory role of type I interferon signaling[J]. bioRxiv, 2020.

1、实验材料：

小鼠、毒株和细胞：

SPF级WT BABL/和C57BL/6小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司；Ad5-hACE2腺病毒由本实验室构建并保存；SARS-CoV-2临床株由本实验室在生物安全三级实验室（BSL-3）分离得到；AD293、Vero-E6细胞购自ATCC。

2、实验环境：

Ad5-hACE2腺病毒转导在负压动物房进行，SARS-CoV-2攻毒及攻毒后实验在生物安全三级实验室（BSL-3）进行。

3、实验操作：

（1）Ad5-hACE2和Ad5-Empty滴鼻转导BABL/c和C57BL/6小鼠

腺病毒通过滴鼻方式进入小鼠肺部。采用气体（异氟烷）麻醉的方式减少对动物的伤害，鼠麻醉后，经历呼吸变慢，然后变快，再变慢的过程，直至进入深大呼吸，在深大呼吸时滴入小鼠鼻孔，转导效果最好。具体转导步骤如下：

1）将小鼠、将塑料干燥器置（底部放入纱布）移至生物安全柜内。

2）在15 mL离心管内加入6 mL矿物油和4 mL异氟烷，混匀后倒入塑料干燥器置的纱布中，让异氟烷缓慢释放。

3）倒入异氟烷2 min后，放入小鼠，盖上盖子，观察小鼠呼吸变化，直到深大呼吸。

4）滴入75 µL Ad5- hACE2或者Ad5-Empty(2.5×108 FFU)，等小鼠完全吸入，等待小鼠从麻醉中恢复，放入鼠笼饲养。

（2）SARS-CoV-2感染转导后BABL/c和C57BL/6小鼠（需在生物安全3级实验室完成）

1）所有的小鼠都要在生物安全柜内进行感染。应用异氟烷（isoflurane）麻醉小鼠。（危险：小鼠抓咬或逃逸。操作要点：小鼠抓取动作轻柔缓慢，不要惊吓小鼠。采用挤压脚掌等方式即时检测小鼠麻醉效果，待麻醉完全后再进行下游操作。）

2）稀释SARS-CoV-2病毒：从–80℃冰箱取出装有SARS-CoV-2病毒的冻存管，应用DMEM稀释SARS-CoV-2病毒至1×105 PFU/50 μl。（危险：溢洒和气溶胶产生。操作要点：使用耐低温冻存管和第二层密封防护盒；打开盖子过程缓慢，稀释过程轻柔。）

3）取出麻醉好小鼠，鼻腔滴注50μl稀释好的病毒。（危险：溅洒。操作要点：老鼠牢固抓取并固定，滴注液体连续轻柔。）

4）等待小鼠从麻醉中恢复，并将其放入新鼠笼中以降低可能的笼内污染。

5）用10%新鲜配置的有效氯消毒液灭活未用完的病毒储存液和稀释液，并高压消毒。

6）每日观察感染小鼠临床指标（呼吸抑制、弓背、无精打采、无法站立和脱水）。

7）Ad5-hACE2转导小鼠5天后，滴鼻感染SARS-CoV-2，每日监测小鼠体重，收取感染后1-8天的肺组织，测定肺组织病毒滴度。另一方面，检测小鼠感染后第2天和第5天肺组织病理变化。

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）Ad5-hACE2转导小鼠模型的构建遵循国家《实验动物 新型冠状病毒肺炎（COVID-19）动物模型制备指南》。依照指南中的动物模型的制备原则，选择冠状病毒动物模型构建中常用、无特定病原体（SPF）级别、经济型小动物即近交系小鼠C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠进行COVID-19腺病毒转导小鼠模型的构建。新型冠状病毒SARS-CoV-2入侵受体为 human angiotensin-convertingenzyme 2（hACE2），而小鼠同源受体mouse ACE2由于氨基酸关键位点差异，不能介导病毒入侵。故本模型的构建采用腺病毒转导hACE2受体分子的方式，使得hACE2表达在小鼠肺脏，经组织免疫化学方法检测，支气管上皮与肺泡上皮细胞表面表达丰富的hACE2大分子。

Ad5转导小鼠后，受体分子可在小鼠肺脏持续表达2-3周。于感染后第五天通过鼻内滴注的方式给予转导受体分子的小鼠1 x 105 FFUSARS-CoV-2感染。感染后每日监测小鼠体重与肺脏病毒滴度、并间断收取小鼠肺脏组织切片观察小鼠肺脏病理变化（见图2）。结果显示，Ad5-hACE2转导组BALB/c小鼠于感染后第二天（2 d.p.i.）开始出线体重下降的症状，4-5 d.p.i.小鼠体重将至最低并随后逐渐回升，于10 d.p.i.感染小鼠体重约回升至原始体重；Ad5-hACE2转导组C57BL/6小鼠在感染后体重变化规律与BALB/c相同，于感染后第二天（2 d.p.i.）开始出线体重下降的症状，6 d.p.i.小鼠体重将至最低并随后逐渐回升，于10 d.p.i.感染小鼠体重约回升至原始体重。 本研究通过噬斑形成实验（Plaque forming assay, PFA）与斑点形成实验（Focus forming assay, FFA）检测小鼠肺脏病毒载量，结果显示，在感染后第一天小鼠肺脏病毒滴度最高，每克组织中病毒滴度可达107 PFU，随后病毒滴度逐渐降低，在BALB/c小鼠中，病毒于7 d.p.i.被清除；在C57BL/6小鼠中，病毒于6 d.p.i.被清除。同时，本研究在小鼠感染后不同时间点收取小鼠肺组织进行固定制备组织切片，通过苏木素/伊红染色观察感染后小鼠肺脏病理变化，结果显示，感染后小鼠肺脏出现出血、炎性细胞浸润等病理改变。综上所述，经腺病毒鼻内滴注hACE2受体方式，可以成功构建对SARS-CoV-2易感的小鼠，并且该小鼠模型可以成功模拟新冠肺炎病人的临床病理表现。

通过对小鼠体重、肺脏病毒载量、肺脏病理损伤变化等指标的检测，结果显示SARS-CoV-2感染小鼠模型成功构建。为进一步了解该Ad5-hACE2转导小鼠模型的特征，本研究通过RNA测序的方式检测小鼠感染后第一天肺脏基因表达的差异，结果显示小鼠抗病毒感染免疫应答被激活，细胞因子信号通路、Toll-like受体信号通路等通路被高度活化。通过对比野生型小鼠与I型干扰素受体缺陷小鼠和干扰素通路关键基因STAT1敲除小鼠在新型冠状病毒感染中的差异，发现I型干扰素在新冠病毒感染中起到保护作用。

Ad5-hACE2转导小鼠在病毒感染后，免疫应答被激活，并且天然免疫在抗病毒感染中发挥重要的免疫保护作用。为进一步解析适应性免疫应答在该小鼠模型中的作用，本研究检测细胞免疫应答与抗体应答规律进行研究。通过体内抗体删除小鼠CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞研究T细胞在病毒感染中的作用，结果显示CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞被删除后，小鼠肺脏病毒载量较对照组明显升高（见图3），此研究结果显示，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞在SARS-CoV-2感染中发挥重要保护作用。为进一步了解细胞免疫在SARS-CoV-2感染中的应答规律，本研究通过体外多肽刺激感染后小鼠肺泡灌洗液中淋巴细胞、细胞内细胞因子染色、流式细胞术的方法解析T细胞应答规律。结果显示，在BALB/c小鼠中，病毒特异性T细胞应答主要针对病毒S1蛋白与N蛋白；在BALB/c小鼠与C57BL/6小鼠中，病毒病毒特异性T细胞应答规律相同：T细胞应答于5 d.p.i.开始出现，8 d.p.i.应答达到高峰，10 d.p.i.病毒特异性T细胞收缩、应答强度下降。在对小鼠体液免疫应答的研究中，我们通过噬斑减少实验（PRNT）对感染后不同时间点小鼠血清中中和抗体滴度进行检测，结果显示，从10 d.p.i.开始，小鼠体内开始出现抗SARS-CoV-2中和抗体。通过疫苗免疫和过继转移免疫血清的方法，揭示抗小鼠S蛋白免疫血清在SARS-CoV-2感染过程中发挥重要的免疫保护作用。

过继转移恢复者患者血浆是临床上常用的抗病毒治疗的疗法，为评价该模型能否模拟临床治疗效果，我们将COVID-19恢复者血浆、SARS-CoV感染者血浆、MERS-CoV感染者血浆、健康人血浆分别过继转移到受体小鼠体内，结果显示只有COVID-19恢复者血浆可以明显降低小鼠肺组织冰帝滴度、减轻小鼠肺脏病理损伤。该结果表明，此Ad5-hACE2转导小鼠模型可以用于评价抗SARS-CoV-2抗体在病毒感染中的治疗效果，具备广泛的应用前景。

瑞德西韦是一种核苷酸类似物药物，前期研究成果与临床试验揭示，该药物是抗冠状病毒的有效疗法，故本研究针对此药物进行动物体内试验，结果显示，给予瑞德西韦组小鼠肺脏病毒滴度较对照组明显降低、肺损伤减轻（见图4）。该研究结果表明，此Ad5-hACE2转导小鼠模型可用于抗新冠药物疗效的评价，将有助于抗新冠药物开发与效果评价。

本研究中所有SARS-CoV-2病毒感染工作均是在生物安全三级实验室（BSL-3）中进行。实验操作遵循国家生物安全指示进行，所采用的消杀措施均可有效灭活SARS-CoV-2。

本动物模型通过实验动物临床症状变化、肺组织病毒载量及病理损伤改变、天然免疫应答、适应性免疫应答、中和抗体与抗病毒药物治疗效果监测等多方位诠释，该Ad5-hACE2转导动物模型成功构建，并且可应用于新冠治疗药物效果评价、疫苗效果测试及新冠致病机制等多方面研究。

此Ad5-hACE2转导动物模型是国际首个非转基因小鼠模型，该模型中受体分子仅表达在小鼠肺脏，避免实验动物在实验过程中因其他组织感染而非呼吸道感染诱发的死亡。相比传统受体转基因小鼠模型，构建周期短（2-3周），不需要特殊繁育，可用于多种基因修饰小鼠动物模型构建；且技术方法简单，易于重复，适宜大规模推广，有利于我国抗病毒药物、抗体、疫苗的应急验证及致病机制研究，并已给我国多家单位广泛共享，有效缓解了我国COVID-19肺炎动物模型缺乏难题。