PINK1突变恒河猴帕金森模型

帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是一种常见的神经系统变性疾病，老年人多见，平均发病年龄为60岁左右，40岁以下起病的青年帕金森病较少见。我国65岁以上人群PD的患病率大约是1.7%。大部分帕金森病患者为散发病例，仅有不到10%的患者有家族史。帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺（dopamine, DA）能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体DA含量显著性减少而致病。导致这一病理改变的确切病因目前仍不清楚，遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等均可能参与PD多巴胺能神经元的变性死亡过程。

帕金森发病多集中于中老年人，中老年人由于其人体机能的下降，总或多或小的伴有各种症状，如若不能很好的帕金森早期症状有个大概的了解，往往会出现误诊，延误病情的情况。曾经就有陈某，在很长时间之前便出现左手不灵活，不经意间手会颤抖的现象，腿脚也会不听指挥。但在当地医院就诊时，却被认为是颈椎病。结果治了半年都不见效，反而继续恶化。为了防止这样的事情再次发生，我们就有必要增进对帕金森早期症状的了解，从而争取能够做到很好的预防。

（1）抖——静止性震颤

震颤是该病的基本特征之一，震颤首先出现于肢体的远端，通常会出现单侧手指搓丸样运动，其后会发展为同侧下肢和对侧肢体在静止时出现不自主的有节律颤抖，变换位置或运动时，症状可减轻或停止。震颤会随情绪变化而加剧。

（2）僵——肌肉僵直

早期多从单侧肢体开始，患者感觉关节僵硬及肌肉发紧。影响到面肌时，会出现表情呆板的“面具脸”；影响到躯干、四肢及膝关节屈曲的“三曲姿势”。指间关节伸直，手指内收，拇指对掌，这也是震颤麻痹的特殊手姿。

（3）慢——行动迟缓

早期患者上肢的精细动作变慢，如系鞋带、扣纽扣等动作比以前缓慢许多，甚至无法顺利完成。行走时起步困难，一旦开步，身体前倾，步伐小而越走越快，不能及时停步，即“慌张步态”。

（4）钝——思维及智能障碍

抑郁可为首发症状，其常见症状如思维缓慢、空间视觉障碍、转移注意力困难、记忆力缺损和执行命令差。

（5）合并其他症状

有时患者还会合并出现语言减少和声音低沉单调、吞咽困难、流涎、睡眠障碍、抑郁或痴呆等症状。

在了解帕金森综合症的早期症状以及做好预防护理之外，对于帕金森患者还要尽早的进行帕金森的治疗，然而目前治疗帕金森疗效最好的方法就是生物细胞疗法，该疗法治疗帕金森疾病主要是通过生物细胞的输入，生物细胞会在帕金森氏病患者脑部直接修复受损的脑组织细胞，恢复脑组织的正常功能，从而从根本上纠正不正常的脑部病理改变。对帕金森的三大症状都会有非常明显的改善，并且可以提高患者的体质，提高生存质量。

在人类，PINK1突变导致常染色体隐性遗传和早发性帕金森病（PD）并伴有选择性神经变性。虽然已经在小鼠及猪产生了相关的疾病模型，但是这些模型并不能概括在PD患者中看到相关的神经变性，这意味着PINK1在哺乳动物大脑中的功能需要使用更接近人类的较大动物进行评估。

PINK1基因缺失恒河猴存在神经变性的表现，且观察到的显著神经元丢失，揭示了PINK1在灵长类大脑中的关键功能，并将提供一个新的研究PINK1的多种功能和与PINK1功能障碍相关的发病机制的工具。

在实验动物存活的猴中，8个携带PINK1突变（M），3个是野生型（WT）。然而，三只突变猴（M1，M3和M4）是新生三胞胎，它们在出生后3-4天内难以存活并死亡。一只WT新生猴也死亡。另一只突变猴（M2）在出生后7天死亡，没有明显的症状。其他三只突变猴（M6，M7和M8）已经存活了三年;然而，M5减少了食物摄入并在1.5年时显示出虚弱状态，并且在麻醉后30天死于MRI检查。

对于存活时间较短的猴，研究人员发现在M1皮质和纹状体以及M2皮质中约65％-70％的PINK1等位基因携带～7.2kb缺失。 PINK1突变猴脑的蛋白质印迹分析也证实了PINK1，神经元蛋白（NeuN，PSD95，CRMP2和SNAP25）和双皮质素（DCX）的不同程度的缺陷。对于活猴，MRI和视频监测研究显示，具有PINK1突变的1.5岁成年猴显示皮质中的灰质密度显著降低。尽管睡眠行为没有改变，M5和M6猴子也表现出运动减少。 对M6猴脑基因组DNA的分析也显示PINK1外显子2和外显子4在各种组织中的大量缺失，并且蛋白质印迹分析显示皮质和黑质中PINK1表达与年龄相比显著降低。

通过对该模型的研究，能更好地了解帕金森病的病因，发病机制，病理特征以及预防和治疗。

本实验采用健康成年SPF级老鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

给予动物鼠笼倾斜、潮湿垫料、高温、噪音、束缚、电击、游泳、昼夜节律颠倒等不同刺激因子，且刺激因子安排为多变性和不可预测，可诱导性是模型制造成功的关键。该模型被广泛用于抑郁症神经生物学机制及抗抑郁药物的研究，以及伴发的焦虑、学习记忆障碍及防护药物研究。

本研究中，通过水迷宫实验、避暗实验结果可以看CUMS模型组水迷宫寻台潜伏期显著性延长，避暗错误次数显著性增加、避暗潜伏期显著性减少等，这些行为学结果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本实验还对CUMS模型的机制进行了基础研究，认为CUMS模型会导致动物皮层的5-HT、DA、Ach、NE等神经递质水平显著性降低（P<0.05）。因此我们认为采用慢性不可预测应激，35天可以造成大鼠和小鼠学习记忆障碍。

模型技术难点在于对于CUMS刺激因子的选择，刺激因子的选择可能影响实验模型的成功与否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、热水游泳(42 °C，5 min)、动物叫声(0.5 h)、束缚(使用自行研发的小鼠行为限制器，长20 cm，直径7 cm)、昼夜颠倒、配对饲养、湿笼、倾笼等。每日选择2~3 种刺激，并尽量使应激程序符合不可预测的特点，以避免动物产生适应性。相同的刺激因子应该隔3-7日再进行。

本研究通过不同的刺激因子对老鼠造成慢性不可预测应激模型，通过水迷宫、避暗等经典行为学指标，以及5-HT、DA、Ach、NE等神经递质基础机制指标，表明了慢性不可预测应激诱导老鼠学习记忆损伤模型的成功，并且该模型对于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于进一步的改善学习记忆药物的药效学评价。