CD4+T细胞GPR68基因敲除黑色素瘤小鼠皮下移植瘤模型

一、疾病概述

黑色素瘤指有恶性变化的色素斑痣，是由交界痣或混合痣性质的痣发展而来。虽然不一定由斑痣恶变，但是慢性刺激和不恰当的治疗对斑痣转变成黑色素瘤有很大的关系。黑色素瘤表现为黑痣突然出现或迅速长大，色泽不断加深，四周出现彗星状小瘤或色素环，局部发生疼痛、感染、溃疡或出血，出现肿大的淋巴结。肿瘤为单一实性，常有包膜，颜色可黑色、红棕色，深浅程度不一，也可无色素性。大多数黑色素瘤是原发性的，累及成人和儿童，特别是有神经皮肤症状的儿童。肿瘤好发于下肢，其次是头、颈、上肢、眼、指甲下和阴唇等处。早期即能由淋巴道和血行转移至肝、脑、骨、黏膜等处。经常受摩擦的手掌、足底和眼部的黑痣以及位于表皮和真皮交界处的黑痣容易恶变，被认为是黑色素瘤的前驱期。

二、模型背景

1、基因信息

Description：Gprotein-coupled receptor 68（GPR68）

[Source：MGI Symbol；Acc：MGI：2441763]

Synonyms：Ogr1，OGR1，BB131428

Location：Chromosome12：100,876,682-100,908,198reverse strand.

Gene ID: 238377

2、实验动物背景信息

C57BL/6J小鼠

3、研究背景

GPR68（G-proteincoupled receptor 68）最初是从卵巢癌细胞HEY中克隆的G蛋白偶联受体（G-proteincoupled receptors，GPCR），其与G蛋白偶联受体4（GPR4），G2积累受体（G2A）及T细胞死亡相关基因8受体（TDAG8）有40%到50%的同源性，同属一个GPCR亚家族[1]。研究发现GPR68是质子激活受体，能通过受体上的组氨酸残基感知细胞外的质子或pH，进而刺激三磷酸肌醇（IP3）的产生，释放细胞内的钙离子[2]。但GPR68下游的信号通路却并不清楚，其相关信号通路的生理作用也鲜为人知。GPCR家族的其它3个成员也被发现是感知质子的受体，被质子激活后，通过异三聚体G蛋白中的Gα（Gα(s)，Gα(i)，Gα(q)和Gα(12/13)），可以激活一系列的细胞内信号通路[2,3]，见图1[4]。

GPR68在胸腺，脾，肺，小肠，结肠，外周血白细胞中均有表达[1]，GPR68在免疫相关的细胞，特别是在CD4+和CD8+T细胞中表达最高[5]。前期研究中发现，敲除GPR68能抑制小鼠前列腺肿瘤和黑色素瘤的发生和发展，且这一抑制作用需要T细胞的直接参与[5,6]。GPR68可能在肿瘤的酸性环境中抑制T细胞的功能，质子通过激活GPR68抑制T细胞的迁移和增殖。因此，若通过阻断GPR68的功能能够提高T细胞在肿瘤微环境中的活性，那么在用于肿瘤免疫治疗的T细胞中阻断GPR68，则能增强过继转输T细胞对肿瘤的治疗效果。

综合前期研究基础，利用GPR68敲除小鼠模型、T细胞功能性实验以及其他生化实验方法，从体内、体外和分子机制等层面深入研究GPR68在T细胞中的功能，特别是GPR68对T细胞抗肿瘤免疫的影响，并通过筛选抑制和激活GPR68靶点的小分子，探寻调节GPR68信号通路的途径，将为肿瘤的T细胞免疫治疗提供新的思路，并为以GPR68为靶点的肿瘤免疫治疗打下基础。

参考文献

[1]XuY, Casey G. Identification of human OGR1, a novel G protein-coupled receptorthat maps to chromosome 14. Genomics. 1996;35:397-402.

[2]LudwigMG, Vanek M, Guerini D, Gasser JA, Jones CE, Junker U, et al. Proton-sensingG-protein-coupled receptors. Nature. 2003;425:93-8.

[3]ImDS. Two ligands for a GPCR, proton vs lysolipid. Acta Pharmacol Sin.2005;26:1435-41.

[4]LiWS, Liu HF, Yan LB, et al. OGR1 and the tumor microenvironment.Chin J CompMed,2019,29(7):96-101.

[5]LiH, Wang D, Singh LS, Berk M, Tan H, Zhao Z, et al. Abnormalities inosteoclastogenesis and decreased tumorigenesis in mice deficient for ovariancancer G protein-coupled receptor 1. PloS one. 2009;4:e5705.

[6]YanL, Singh LS, Zhang L, Xu Y. Role of OGR1 in myeloid-derived cells in prostatecancer. Oncogene. 2014，33, 157–164.

（一）构建GPR68-FloxP小鼠

1、实验设计

GPR68只有一个蛋白编码区exon1。因此在exon1的两边设计gRNA靶点，将FloxP基因插入GPR68基因两端。

2、Cas9/gRNA的活性检测

采用北京唯尚立德Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒检测gRNA靶点体外酶切活性。选体外活性高的gRNA显微注射受精卵，取胚胎检测内源活性。根据Cas9/gRNA的内源活性结果，选用活性较高的gRNA进行后续实验。

3、构建同源重组模板（Donor质粒）

根据靶点的位置设计并构建DonorDNA。

4、基因敲除小鼠的建立和和品系交配GPR68-FloxP小鼠的构建

将Cas9nickase、GPR68-L1和GPR68-R1体外转录成mRNA和RNA后，加上Donor DNA显微注射到小鼠的受精卵中，以获得基因敲入的小鼠。采用直接注射受精卵实现基因敲除，由于在受精卵发育早期，甚至单细胞时期就发生基因敲入，因此小鼠嵌合率高，小鼠传种的几率比囊胚注射ES Cell高。

小鼠出生2周后，剪鼠尾，提取基因组DNA进行PCR加上测序检测小鼠基因型，测序检测是否实现了两个位点的FloxP准确插入。

图3 GPR68-FloxP小鼠与CD4-Cre小鼠杂交

将GPR68-Flox/Flox小鼠与CD4-Cre小鼠杂交，子代小鼠即为CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠。

（二）皮下移植黑色素瘤模型的构建

1、用0.25%胰酶消化细胞收集细胞悬液，用预冷的PBS重悬细胞，1000rpm离心5min，洗涤细胞两次，除去单细胞悬液中的血清。

2、对细胞进行计数，用PBS稀释细胞至浓度为2.5×106个/mL，接种体积控制在0.2mL。

3、采用1mL无菌注射器于小鼠腋下部位接种细胞。接种时将单细胞悬液充分混匀，防止细胞成团导致活性降低以及接种细胞数不均，左手固定小鼠，右手执注射器，针头在皮下穿行时避免刺破皮肤与肌肉，到达接种位点并注射完毕后退出针头时避免细胞悬液溢出。

4、每3天用游标卡尺测量肿瘤大小，测量肿瘤最长和最短直径。肿瘤体积计算公式为V=a×b2/2(a为长轴，b为短轴)。

5、接种后第20天实验结束，采用颈椎脱臼法处死小鼠，解剖取出肿瘤组织，称量小鼠肿瘤重量。

在无特殊刺激的情况下，CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠没有明显表型，且外观与同背景WT小鼠无明显差异。分别从DNA、mRNA、蛋白水平检测CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠组织中GPR68表达，如图4所示，在此三个水平上均不能检测到GPR68。

图4 鉴定GPR68-/-小鼠组织中GPR68的表达

a.鼠尾DNA水平的鉴定；b.mRNA水平鉴定；c.蛋白水平鉴定

分别对WT与CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠进行皮下注射接种5×105个B16细胞，观察并检测肿瘤生长情况。接种后第20天，采用颈椎脱臼法处死小鼠，称量小鼠肿瘤重量体积等。如图5所示，与WT小鼠比较，CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠能够明显抑制黑色素瘤的生长。

图5 CD4+ T 细胞GPR68敲除对黑色素瘤生长的抑制作用

a. 肿瘤大小；b.肿瘤重量；c.肿瘤体积

GPR68-FloxP小鼠由北京唯尚立德生物科技有限公司设计并制备，与CD4-Cre小鼠杂交后后代可稳定遗传，在无特殊刺激的情况下，CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠没有明显表型，其表型与野生型C57BL/6J小鼠无明显差异。GPR68敲除小鼠饲养于SPF级环境中，机体内无特定的病原微生物和寄生虫存在。

CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠CD4+T细胞在DNA、mRNA、蛋白中均检测不到GPR68表达，证实构建成功。通过荷B16黑色素瘤发现，CD4+T细胞GPR68特异敲除后，显著抑制了肿瘤的恶性增殖。

前期研究显示T细胞表达高水平的GPR68，可能介导了肿瘤酸性微环境对T细胞的抑制作用，但是GPR68在T细胞中的具体功能以及如何介导了酸性pH对T细胞的抑制作用尚不清楚，其机制有待进一步研究。

肿瘤免疫治疗需要抑制机体的免疫耐受，激活免疫细胞（主要是T细胞），增强免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤，而肿瘤的微环境（包括酸性pH）是减弱免疫治疗效果的重要原因。GPR68在T细胞中的表达以及对肿瘤的发生发展的影响是全新的发现，研究GPR68在T细胞中的功能，特别是GPR68对T细胞抗肿瘤免疫的影响，将为肿瘤的T细胞免疫治疗提供新的思路。并且，GPR68敲除小鼠在正常生理条件下无异常表型，以此推测若在体内用药物抑制GPR68可能不会引起严重的生理问题，副作用相对较小，因此GPR68可能是很好的药物靶点。