非酒精性脂肪性肝病斑马鱼模型

一、疾病名称

非酒精性脂肪性肝病（Non-Alcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD）

二、临床发病机制及症状

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)被认为是仅次于酒精和病毒性肝炎导致肝硬化的第三大病因。NAFLD 是指除外酒精和其他明确的肝损伤因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪性肝病以及由其演变的脂肪性肝炎和肝硬化。肥胖、II 型糖尿病、高脂血症等单独或共同成为 NAFLD 的诱因。NAFLD 多伴有中心性肥胖、胰岛素抵抗和脂质代谢紊乱，也被认为是代谢综合征的一种表现。病理特征：以大泡性或以大泡性为主的肝细胞脂肪变性为特征。

三、模式动物

斑马鱼(Zebrafish, Danio rerio) AB 或 TU 野生型品系均可。

1. 实验动物

野生型斑马鱼 AB 品系。

2. 造模化合物及斑马鱼处理

采用高脂、高糖、高胆固醇三种饮食方案饲喂斑马鱼幼体。具体方案见图1（Ref.1）。主要步骤：取野生型斑马鱼幼体(5 dpf)，随机分为4组：正常饮食(30mg/d AP100)、高胆固醇(30 mg/d AP100 plus 4% (w/w) cholesterol)、高糖(30 mg/dAP100 plus 0.25%(w/v) fructose)、高脂(180 mg/d AP100)，按照gezi 饮食方案饲喂10天。饲喂终止后，空腹过夜，收集幼体进行后续实验检测。为了观察胆固醇在体内的分布，在4组食物中添加BODIPY 标记的胆固醇(10μg/g cholesterylBODIPY 542/563-C11, Invitrogen)。

3. 模型分析指标

（1） 症状观察2观察和拍照斑马鱼表型；测量斑马鱼幼体体长和称重，统计学处理并比较 4组数据。

（2） 病理检测A. 对斑马鱼整体进行油红染色，检测体内脂质蓄积水平和分布；荧光显微镜下观察 BODIPY 标记的胆固醇在体内的分布和强度。B. 肝脏冰冻切片和油红 O 染色；C. 肝脏石蜡切片和 H.E 染色。

（3） 病理诊断 采用肝脏组织切片和 HE 染色检测，以脂质/胆固醇在肝脏蓄积、或以大泡性为主的肝细胞脂肪变性为特征。

1. 动物症状观察高胆固醇、高糖、高脂饮食的三组幼体体长均比 WT 组幼体体长增长。但高胆固醇、高脂饮食导致斑马鱼体重增加、肝区扩大，高脂组的幼体腹部和头部的透明度明显降低。高糖组体重未见变化，但头部和内脏区透明度也明显下降(图 1)。

图1. 高胆固醇、高糖或高脂饮食对斑马鱼幼体生长的影响(A) 四组不同饲喂方案；(B) 四组饮食饲喂终点时的幼体表型；(C) 幼体在15 dpf 的平均体3长 (n = 20).；和平均体重(n = 10，每组从100条中随机取10条幼体称重）。a, 与对照组比较; b,与EF组比较; c, 与HF组比较; *P < 0.05, #P < 0.01; Bar = 1 mm.2. 病理改变体内总胆固醇和总脂升高，显微镜下可见肝脏有明显脂质蓄积和脂肪泡，肝结构改变（图 2）。生化指标检测显示：过量饮食组的总脂质/甘油三酯、胆固醇和葡萄糖均明显高于对照组。胆固醇组的总脂质/胆固醇明显高于对照组，甘油三酯略高，葡萄糖低于对照组。高糖组的总脂质、甘油三酯和葡萄糖均高于对照组，而胆固醇水平与对照相当（图 2F-I）。

图 2. 脂质在斑马鱼幼体体内的蓄积A. 油红染色示不同饮食组的幼体肝区脂质水平；B. 示四组幼体肝区胆固醇的蓄积水平；C. 示四组幼体躯干血管的胆固醇水平； D. 肝脏冰冻切片和油红 O 染色显示脂质在肝区的蓄积和脂肪变性；E. 肝脏石蜡切片和 H.E 染色显示肝小叶排列变化和肝细胞内脂肪泡情况；F. 油红染色阳性区半定量统计比较；G. 胆固醇与每毫克蛋白之比；H. 甘油三酯与每毫克蛋白之比；I. 糖与每毫克蛋白之比。F-I 数据来自斑马鱼肝脏。*P < 0.05 vs. Control. Bar =100 μm。

模型动物饲养在武汉大学人民医院动物房SPF级动物实验室，实验动物使用许可证SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特点

门采用专用净化密闭门并配备观察窗。单向走道呈顺时针走向设计。屏障系统内共有大鼠饲养室1间，小鼠饲养室3间，隔离观察室1间，实验准备室1间，洁物存放室1间，清洗消毒室1间。此外，屏障系统外配有监控室、机房和配电室等。

（2）设计参数

室内温度：20～26°C；日温差：≤4°C；相对湿度：40%～70%；换气次数：15～20次/h；气流速度：≤0．2m/s；压强梯度：20～50Pa；空气洁净度：7级；菌落数：≤3个/皿；氨浓度：≤14mg/m3；噪声：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；动物照度：15～20lx；昼夜明暗交替时间：12/12h。

（3）通风和空调系统

动物实验室采用全新风中央空调通风系统。空气经过初、中、三级过滤器后进入实验室内环境。

（4）照明系统

一更、淋浴、二更、气闸、清洁走道、洁物存放处、污物走道、缓冲间和清洗消毒间、动物饲养室、实验准备间、隔离观察室和功能实验室等安装有手动和自动开关，根据实际需要，调节控制室内照明灯。未启用房间、清洁走道、洁物存放处、污物走道等在每日中午12点和晚上8点开启紫外线灯照射1h。

（5）通讯系统

因为SPF级动物实验室的环境和设施具有特殊要求，人员进入后不能随意出入，而室内外的联系又十分重要，故室内各房间均安装内部电话机，按照房间顺序编排电话号码，各室内电话可相互连通，并均与监控室总机保持联系，保证实验室内外信息的及时沟通。

（6）监控系统

对SPF级动物实验室的出入口、走道、实验动物饲养室、功能操作室等重要位置均安装了可作270°旋转的摄像机，能够及时了解设施的运行状态；也能有效督促实验人员执行科学的操作规程，避免人为因素造成室内环境和设施的污染；并对整个实验期间的动物状态和反应进行观察，减少对动物的滋扰。

（7）供水系统

SPF级实验动物饮用水以纯净水为宜。本实验室采用管道供水，将处理后的纯净水用塑胶管道输送到屏障系统内实验准备室，设置接水槽，为实验动物供应灭菌的饮用水和屏障系统内用水。要经常更换和清洗输水管道，清洗笼具的用水添加适当比例的84消毒液。

（8）供电系统、警报系统和消防设施

SPF级动物实验室要求全天候不间断供风和供电，如果出现故障，不能及时发现和处理，就可能导致环境设施的污染、动物感染或死亡，造成严重后果。因此应对SPF级动物实验室使用独立稳定的供电系统，并配备有应急电源。在中央空调机房控制室安装风机故障警报系统，以便及时检修和维护，保证设施的安全运行。

（9）消毒灭菌设备

为防止外界物品进入SPF级动物实验室时所携带的细菌污染室内环境和造成动物交叉感染，按照不同物品的特性，进行紫外线照射消毒、渡槽消毒液消毒或专用的机动门真空灭菌器消毒。

（10）动物饲养笼具

饲养大、小鼠的笼具聚碳酸脂材料的塑胶笼具，具有高透明、耐高压、耐高温、耐酸碱等特点。通用的不锈钢笼具长、宽、高分别为40、30、20cm，适用于单笼饲养有特殊要求的实验动物，配有底盘和食槽，确保实验动物有充足的采食和活动空间，同时也保证室内环境的清洁。

（11）垫料的选择和使用

在使用塑胶垫料时，垫料是大小鼠直接接触的铺垫物，起到吸湿、保暖和造窝的作用。垫料的好坏直接影响到大小鼠术后的恢复、生长发育和繁殖性能。目前，所使用的垫料主要有玉米秸垫料、刨花垫料。

（12）饲料配制

大小鼠的生产型饲料和维持型饲料必须严格按照国家标准，进行科学配制生产。每半年检测一次饲料的微生物指标和有效营养成分指标，保证饲料的质量。

该模型通过长期观察普通狼疮小鼠模型，待其到40周龄时，检测其dsDNA等，结合皮肤症状变化，来确定慢性狼疮皮肤病模型的建立。目前国际上尚欠缺类似模型，为研究狼疮皮肤病发病机制提供了工具。