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ddx18 基因敲除斑马鱼白血病模型

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模型信息

中文名称:ddx18 基因敲除斑马鱼白血病模型

英文名称:NA

类型:白血病动物模型

分级:NA

用途:用于白血病研究。

研制单位:中国医学科学院医药生物技术研究所

保存单位:中国医学科学院医药生物技术研究所

研究背景

一、 疾病名称

遗传性粒性白血病 (Hereditary Myeloid Leukemia)

二、 临床发病机制及症状

白血病是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病,其特点是在骨髓和其他造血组织中白血病细胞广泛而无控制地增生,并浸润、破坏全身各组织器官。造血细胞的某一系列、主要是某一白细胞系列的前体细胞失去分化成熟能力,在骨髓中和其他造血组织中呈恶性克隆性增生、积聚,并侵犯肝、脾、淋巴结,最终浸润破坏全身组织、器官,使正常造血功能受到抑制。白血病会导致正常造血功能受抑制,外周血出现幼稚细胞。临床上常有贫血、发热、出血和肝脾淋巴结不同程度肿大等表现。一般而言,大多数白血病属于获得性疾病。然而研究表明,一些家族染色体可能带有血液病的易感基因,即此类易感基因使人更容易患上白血病。新近临床研究发现一些粒性白血病病人携带有 ddx18(DEAD-box 18)基因的突变;动物实验证明该基因与粒性血细胞发育相关。DDX18 蛋白是一种高度保守的 RNA 解螺旋酶。斑马鱼 ddx18 基因位于斑马鱼 9 号染色体上;其 DDX18 蛋白序列与人类 DDX18 序列有 72%的同源性。

三、 模式动物

斑马鱼 TU 系。

制备方法

1. ddx18 基因敲除斑马鱼的制备 委托基因公司采取基因编辑技术制备 ddx18 基因敲除的 F0 代杂合子斑马鱼 3 条。

2. ddx18 基因敲除斑马鱼的验证将获得的 F0 代杂合子斑马鱼进行交配,获得 F1 代胚胎。将 F1 胚胎按常规饲养至性成熟,取 3-4 月龄的 F1 成鱼,编号、剪取部分尾鳍,提取基因组 DNA,克隆相关基因片段、测序鉴定基因型,筛选基因组 ddx18 敲除的突变体。

3. 携带 ddx18 突变等位基因的 F2 突变体的筛选鉴定将 ddx18 敲除的 F1 代雌雄斑马鱼继续交配,获得 F2 代,待其性成熟后,同上,2取 F2 代成体斑马鱼少量尾鳍,提取基因组 DNA,利用 ddx18 特异性引物进行 PCR扩增,测序鉴别 ddx18 敲除成功的斑马鱼进一步繁殖、或用于后续实验。Ddx18 基因表达检测:根据该基因 mRNA 设计引物,取 F2 代幼体,采用 RT-PCR 检测 ddx18 基因转录产物,并测序验证其产物突变或缺失。

4. 模型分析指标

(1)外周血涂片检测 ddx18 基因缺失对血液细胞类型的影响取 3-4 月龄野生型和 ddx18 基因缺失的斑马鱼外周血涂片、瑞氏-姬姆萨复合染液染色,进行非红细胞分类计数(包括原始粒细胞、幼稚粒细胞、杆状中性粒细胞、分叶中性粒细胞、血栓细胞、淋巴细胞和单核细胞)和细胞形态分析。

(2)免疫印迹计数检测 ddx18 基因缺失对斑马鱼血液发生标志蛋白的影响取不同“家系”的 ddx18 敲除的斑马鱼幼体(5 dpf)(野生型 5 dpf 斑马鱼幼体做对照),提取总蛋白,Western Blot 检测血液发生标志蛋白 C-myb,Thrombopoietin,G-CSF,CD41 蛋白水平。

评价验证

1. 外周血涂片检测 ddx18 基因缺失对血液白细胞类型的影响取 WT 和 DDX18 敲除的斑马鱼成鱼外周血涂片,进行非红细胞分类计数和细胞形态分析(图 1 A、1C)。基因 ddx18 缺失的斑马鱼外周血细胞与正常鱼比较,原始粒细胞和幼稚粒细胞明显增多,血栓细胞略有减少(图 1 B,图 1 D),表明 ddx18 敲除的斑马鱼具有髓系白血病的特征。

2. 免疫印迹方法检测 ddx18 基因缺失对斑马鱼血液发生标志蛋白的影响 以 WT 型斑马鱼为对照,检测血细胞发育相关基因,结果显示,敲除 ddx18 基因后,限定性血液干细胞(Definitive HSC)标志蛋白 C-MYB 和 CD41 和血栓细胞标志蛋白 TPO 水平明显升高,而髓系标志蛋白 G-CSF 的短型同源物缺失(图 2)。这些结果证明 ddx18 基因缺失可影响髓系早期血细胞的发育。

图 1. 野生型与 ddx18 基因敲除斑马鱼血细胞形态学分析A: 野生型斑马鱼外周血细胞分型; B:野生型斑马鱼外周血细胞分类计数;C: ddx18 基因敲除斑马鱼外周血细胞分型;D:ddx18 基因敲除斑马鱼的外周血细胞分类计数。

图 2. 野生型与 ddx18 基因敲除斑马鱼的血细胞标志蛋白

生物安全性

实验中涉及动物的操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准(ILAS-GC-2012-001)。

讨论与结论

动物症状观察:

表现为体重减轻、弓背竖毛,在回输后的一个月后死亡。

注意:因业务调整,暂不接受个人委托测试。

以上是关于ddx18 基因敲除斑马鱼白血病模型的相关介绍,如有其他疑问可以咨询在线工程师为您服务。

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