PON1基因敲除大鼠模型

一、疾病概述

我们的模型研究结果证实PON1敲除损伤免疫T细胞的发育，并显著调节神经免疫细胞——小胶质细胞的极化，之前的文献报道揭示了PON1参与抑制单核-巨噬细胞的分化，均提示PON1可作为一种新的免疫调节因子。该动物模型涉及到小胶质细胞相关的炎症反应和T细胞发育两方面，分述如下：

小胶质细胞是脑内常驻的免疫细胞，数量约占人脑细胞总数的0.5-16.6%，又称脑内的巨噬细胞，构成中枢神经系统的第一道防线。生理状态下的小胶质细胞处于相对的静息状态，因此被称为静息型小胶质细胞(resting microglia)。静息型小胶质细胞在发育的神经系统中起着调控神经元存活和修饰突触的作用，并且在成熟的健康脑中具有探测和调控神经元活动的功能；在炎症刺激病理状态下，包括在脑损伤、病原入侵以及退行性疾病中，小胶质细胞首先启动，迁移至损伤部位，转化为激活状态，呈现阿米巴虫样的典型巨噬细胞形态，因此被称为阿米巴样小胶质细胞(amoebic microglia)。小胶质细胞激活大体分为M1经典激活型和M2选择激活型。M1型为促炎状态，小胶质细胞释放大量的促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α、白介素1β、白介素6或白介素12，这些炎性因子会对神经细胞产生毒性作用, 严重的会致使神经细胞凋亡；M2型为抗炎状态，能够释放抗炎性细胞因子如白介素4、白介素13，吞噬损伤的神经细胞碎片、促进组织修复和神经元的再生。

神经炎症反应是许多神经退行性病变的重要病理基础，在神经系统创伤后的神经退变中也发挥重要作用。小胶质细胞通过吞噬作用清除细胞碎片，并释放神经生长及抗炎因子而减轻神经损伤，促进组织修复。然而很明显，小胶质细胞高度活化状态可释放高水平的促炎因子及细胞毒性物质，从而造成神经元失能及细胞死亡。神经系统损伤后，活化的小胶质细胞及浸润的巨噬细胞具有异质性。

胸腺是机体的重要免疫器官，由皮质和髓质两部分组成，主要包括胸腺上皮细胞和T淋巴细胞。T淋巴细胞(T细胞)是淋巴细胞的一种,在免疫反应中扮演着重要的角色。T细胞在胸腺中发育经历CD4-CD8-(Double negative,DN)、CD4+CD8+(Double positive,DP)及CD4+或CD8+(Singlepositive,SP)三个主要阶段,最后进入外周淋巴组织。胸腺病变将对机体免疫功能带来严重影响，使机体免疫自稳功能紊乱并伴发自身免疫性疾病。但是，目前对于胸腺发育和T淋巴细胞产生的分子机制仍不清楚。

二、模型背景

1、PON1信息

人类的对氧磷酶家族包括3个成员即PON1、PON2 和PON3，其中PON1是由354 个氨基酸组成的相对分子质量约为43000～47000的糖蛋白。目前的研究表明，PON1 主要由肝脏合成，大部分结合在肝脏细胞内微粒体上，在人体广泛分布于肝脏、血液、肾脏、脾脏、肠及脑，其中在肝脏和血液中活力最高。PON1 在血液中借助于疏水的N 端和载脂蛋白AI 紧密结合，固定于高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)颗粒上。PON1 因能水解对氧磷而命名为对氧磷酶，实际上PON1 是一个可以水解多种内源或外源物质的、多功能的水解酶，其底物可归为芳香类和内脂类二类。PON1 参与脂代谢、药物代谢和毒物代谢等多种病理和生理过程。与心脑血管病，糖尿病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病和神经退行性疾病等多种疾病有关。

2、实验动物背景信息

SD大鼠

3、研究背景

该动物模型的研究目的及意义；该动物模型的国内外研究进展并附参考文献。

3.1该动物模型的研究目的及意义

对氧磷酶1（paraoxonase 1, PON1）是AD 的风险基因，PON1 与AD 的关系目前停留在流行病调研水平，机制研究尚未见报道。PON1 是否也通过抗氧化或抗炎症作用抵抗AD 的发生发展，机制如何，仍有待开展更多研究工作加以论证。PON1基因敲除大鼠可以用于研究PON1功能缺失对于免疫功能的影响。

更深入地讲，小胶质细胞的吞噬作用是阿尔茨海默病中Aβ清除的主要途径之一。TREM2已经成为近五年国内外AD 研究前沿热点和潜在治疗靶点之一。TREM2 可调控小胶质细胞由M1 型（神经损伤）向M2 型（神经保护）转变，是调控小胶质细胞活化状态的重要信号蛋白[1]。最新证据显示，在小鼠模型中TREM2 除了能减少与AD 相关的病理，还能够缓解认知功能上的缺陷[2, 3]。这提示使用大脑现有的免疫机制来清除淀粉样蛋白可以作为一种治疗AD 的新策略，可通过上调TREM2 的表达或激活TREM2 信号通路实现。我们的研究发现PON1与TREM2之间存在互作关系，我们利用PON1基因敲除大鼠，展开研究将深化对这一脑内免疫机制的理解。

3.2 国内外研究进展

在过去20年，PON1的研究主要集中在心脑血管病方面，一是PON1多态性与粥样硬化、冠心病、脑梗死等的相关性[4, 5]；二是PON1 在血浆中的水平作为心脑血管病预警标志物研究。在PON1 分子机制方面反而没有大的进展，仅仅报道了PON1在脂代谢和血管疾病中的可能发挥抗炎和抗氧化作用[6-10]。

迄今，PON1 与AD 等神经退行性疾病的关系目前停留在流行病调研水平，研究认为PON1的多态性是AD或PD的危险因子或某些多态性携带者对环境致病因素更敏感[11-16]，血浆中的PON1 低活性也是AD 的危险因素[17, 18]，因此PON1是AD和PD的风险基因，然而，PON1参与AD的分子机制研究尚未见报道。

国际上此前虽然有过PON1基因敲除小鼠的研究报道，但只是聚焦于PON1基因敲除提高巨噬细胞的氧化应激和动脉粥样硬化疾病相关的研究[19]，没有PON1基因敲除大鼠及调节免疫的相关报道。目前，仅有我们首次报道了PON1基因敲除大鼠的建立以及有关免疫T细胞发育受损的研究，以及关于PON1基因敲除大鼠脑部小胶质细胞异常活化的最新的研究成果[20]，因此PON1基因敲除大鼠模型的建立以及利用该动物模型开展的神经系统炎症表型研究和分子机制研究，为AD和神经系统研究提供了工具动物模型支撑。

参考文献：

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[2] Zhao, Y., et al., TREM2 Is a Receptor for beta-Amyloid thatMediates Microglial Function. Neuron, 2018. 97(5): p. 1023-1031e7.

[3] Lee, C.Y.D., et al., Elevated TREM2 Gene Dosage ReprogramsMicroglia Responsivity and Ameliorates Pathological Phenotypes in Alzheimer'sDisease Models. Neuron, 2018. 97(5): p.1032-1048 e5.

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[5] Mackness, M. and B.Mackness, Human paraoxonase-1 (PON1):Gene structure and expression, promiscuous activities and multiplephysiological roles. Gene, 2015. 567(1): p. 12-21.

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[13] He, X.M., et al., Gln192Arg polymorphism in paraoxonase 1gene is associated with Alzheimer disease in a Chinese Han ethnic population.Chin Med J (Engl), 2006. 119(14): p. 1204-9.

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[18] Bednarska-Makaruk, M., et al., Positive correlation ofparaoxonase 1 (PON1) activity with serum insulin level and HOMA-IR in dementia.A possible advantageous role of PON1 in dementia development. J Neurol Sci,2013. 324(1-2): p. 172-5.

[19] Rozenberg O , Rosenblat M , Coleman R , et al.Paraoxonase (PON1) deficiency is associated with increased macrophage oxidativestress: studies in PON1-knockout mice[J]. Free Radical Biology & Medicine,2003, 34(6):774-784.

[20] Lin Bai, Guiying Shi, Yuanwu Ma, Li Zhang,Feifei Guan, XuZhang, Yanfeng Xu, Houzao Chen & Lianfeng Zhang. Paraoxonase1 knockout ratshave impaired T cell development at the CD4/CD8 double-negative todouble-positive transition stage. Sci Rep, 2018. 8(1): p. 14457.

1. 实验材料

1.1实验动物

SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司和北京华阜康生物科技股份有限公司。

1.2主要实验仪器

Nikon显微注射仪

Nikon光学显微镜

BIO-RAD电泳仪

Tanon电泳槽

Tanon数码凝胶图像处理系统

Incucell恒温培养箱温控

TAITEC振荡箱

Eppendorf离心机

Eppendorf移液器

2.实验操作规程和动物处理伦理

模型制作中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003，简要步骤如下：

2.1 供卵雌鼠超排

实验第一天8：00腹腔注射PMSG30IU/只(0.6ml／只)，46～48h以后，实验第三天10：00腹腔注射HCG30IU/只(0.6ml／只)，注射HCG后立即与与种鼠1：1合笼。实验第四天8：00～9：00检查阴道栓，有阴道栓的大鼠在大鼠标牌上注明日期和⊕（阳性），捡出有阴栓的大鼠进行受精卵的收集。

2.2 受精卵的收集

2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，脱颈处死，解剖大鼠，找到卵巢，输卵管和子宫，将卵取出，用透明质酸酶消除胚泡的黏着，使卵分离。在移换到另外的培养液中，要将透明质酸酶充分洗净（洗约3~5次）。

2.3 向受精卵雄性原核注入DNA溶液

2.4. 仅将未损坏的完成操作的卵收集起来，移植到假妊娠大鼠输卵管中。术后将大鼠置于安静的环境下饲养。

2.5 基因表型鉴定

在判定有导入基因大鼠之后，立即将基因修饰大鼠另行饲养，对不用的大鼠进行处理。阴性大鼠的处理：（1）留和阳性大鼠等量的阴性大鼠对照。（2）剩余的阴性大鼠用于其它符合动物伦理的其他实验室的实验（保存记录）。

3. PON1基因敲除靶点设计与测序鉴定

利用CRISPR/Cas9技术建立基因敲除大鼠，sgRNA 的作用靶点位于第四外显子。通过显微注射成功获得敲除大鼠，其中首建鼠F0（#20）敲除片段大小为342bp，能够稳定传代。PON1 杂合子大鼠之间杂交得到同窝阴性对照大鼠和敲除纯合子用于实验研究。大鼠模型资源详见（SD.Pon1(tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）

图1 PON1基因敲除设计策略

1.PON1基因敲除大鼠的蛋白表达鉴定。

1.1 PON1蛋白在基因敲除大鼠的脑组织和小胶质细胞中表达缺失。

图2 PON1在脑和小胶质细胞中的蛋白表达水平鉴定

1.2 PON1蛋白在基因敲除大鼠的胸腺组织表达缺失。

图3 PON1在脾和胸腺免疫器官中的蛋白表达水平鉴定

1.3 PON1敲除降低LPS诱导致死率。

图4 PON1敲除大鼠和野生型大鼠LPS实验中的生存率分析

1.4 PON1 敲除降低LPS诱导后血清中的TNF-α水平。

图5 PON1敲除大鼠和野生型大鼠LPS实验血清的ELISA分析

图6 PON1敲除大鼠和野生型大鼠神经小胶质细胞免疫组化分析

1.6 PON1 基因敲除可使小胶质细胞产生抑炎、促吞噬的表型。

1.6.1 PON1敲除大鼠小胶质细胞吞噬功能增强

图7 PON1对小胶质细胞吞噬功能的调节

1.6.2 PON1 敲除降低LPS诱导的促炎性细胞因子分泌

图8 利用Luminex 和ELISA方法检测细胞上清中细胞因子的分泌水平。

1.6.3 PON1敲除导致胸腺变小，胸腺细胞减少

图9 PON1敲除大鼠和野生型大鼠胸腺细胞对比分析

模型制作及动物实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18002和ZLF18003。本实验部分使用了基因修饰动物（基因敲除），如果动物逃逸，将会造成的环境潜在的基因污染。实验动物饲养繁殖于三楼动物房屏障环境中，整个实验过程中保证动物处于监管状态，无逃脱可能。动物房出入口安放挡鼠板，严防动物逃逸，定期对门窗进行检查，保证严密，动物笼具一经发现破损，立即更换，饲养人员出入确保动物房门关紧并锁住等。含重组DNA的废弃核酸样品、离心管、枪头等用1M NaOH溶液浸泡后，装入密封袋中，统一送到化学废弃物处理公司处理。

国际上此前虽然有过PON1基因敲除小鼠的研究报道，但只是聚焦于PON1基因敲除提高巨噬细胞的氧化应激和动脉粥样硬化疾病相关的研究[19]，没有敲除大鼠以及免疫调节的相关报道。目前，仅有我们首次报道了PON1基因敲除大鼠的建立以及有关免疫T细胞发育受损的研究，以及关于PON1基因敲除大鼠脑部小胶质细胞异常活化的最新的研究成果[20]，因此PON1基因敲除大鼠模型的建立以及利用该动物模型开展的神经系统炎症表型研究和分子机制研究，为免疫学和神经炎症研究提供了工具动物模型支撑。大鼠资源详见（SD.Pon1(tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）