帕金森病斑马鱼模型

一、疾病名称 帕金森疾病 (Parkinson’s disease, PD)二、临床发病机制及症状 帕金森疾病是中老年人的慢性神经系统退行性疾病，发病年龄在 40－70 岁之间。PD 发病与以下因素相关：1.脑老化，随人的增龄，黑质多巴胺能神经元不断死亡，当 80％的神经元死亡时可出现 PD 症状。2. 具有遗传性，a-突触核蛋白及 Parkin 等基因突变与少数家族性 PD 相关。3.环境因素，一些外源性或内源性毒素可引起黑质纹状体神经元死亡，如海洛因吸食者出现 PD 样症状，后者被证实含有神经毒素 MPTP。4. 其它疾病和外伤导致的脑神经损伤，如脑梗等脑血管病变和创伤导致的脑神经元死亡。临床 PD 主要有 4 大症状：静止性震颤、运动缓慢或少动、肌强直及姿态平衡障碍。

1. 造模化合物1-甲基－4－苯基－1,2,3,6－四氢吡啶（MPTP）是一种神经毒素，常用于制作帕金森病动物模型。2. 实验动物野生型斑马鱼 AB 或 TU 品系。斑马鱼饲养和管理均按照常规方法。饲养空间温度 28-30°C。3. 造模化合物处理MPTP 为 Sigma (M0896) 产品，MPTP 母液用纯水制备，浓度为100 µM，储存于－20 °C. MPTP工作液用饲养液稀释至50、100、200、500 µM。将斑马鱼2幼体暴露于MPTP 工作液24小时，收集幼体，进行下一步处理。4. RT-PCR检测PD相关基因转录水平

收集斑马鱼于 TRIzol reagent (Sigma).提取总 RNA，进行 RT-PCR 检测 PD相关的基因表达水平。PCR 引物见表 1。

5. 原位RNA杂交收集斑马鱼于4% paraformaldehyde固定。Th基因探针片段为PCR产物（表1），并被克隆到载体pGEM-T质粒上。探针的合成按照试剂盒(DIG RNA labeling kit(Roche Applied Science, 1175041)）说明制备th基因RNA杂交探针。按照操作程序将斑马鱼样本与探针温育、检测、拍照。

6. 原位免疫荧光检测按照常规程序，将斑马鱼幼体与TH蛋白单克隆抗体(Minipore, MAB318)温育，然后用FITC-标记的二抗温育、洗涤，显微镜下检测、拍照。

7. Western blotting用RIPA lysis kit (Applygen Technologies Inc., C1053)提取斑马鱼总蛋白，进行SDS-PAGE、转膜，用PD相应蛋白的抗体和二抗进行检测。β-ACTIN抗体，3mouse anti-human ACTB antibody (Zhongshan Goldbridge, TA09); 小鼠anti-GAPDH mAb (Zhongshan Goldbridge, TA08); 兔anti-mouse TH monoclonalantibody (Minipore, MAB318); PINK1 (D8G3) 兔mAb antibody (CST, catalog no.6946); Parkin mAb antibody (CST, catalog no. 4211); β-syn (Syn205) 小鼠mAbantibody (CST, catalog no. 2644)。

8. 斑马鱼行为学实验幼体行为记录采用ZebraLab (法国Viewpoint, ZebraLab 3.3)仪器，幼体逐个放入96-孔板，(1 fish/well). 记录运动距离、游泳持续时间、速度和游泳轨迹。每5分钟记录一次数据。

（1） 症状观察斑马鱼幼体（6 dpf）行为: 考察、记录其游泳速度和姿态、持续时间、运动距离；静止时身体平衡情况、有无颤抖等。

（2） 生物标志物检测斑马鱼暴露于 MPTP 中持续 24 小时，收集幼体，提取总 RNA 和蛋白，进行 RT-PCR 和 Western blotting 检测 PD 相关的基因和蛋白：TH、β-SYNUCLIN、PARKIN、PINK1。

（3） 病理诊断采取原位杂交和原位免疫荧光方法，检测斑马鱼中脑/间脑多巴胺神经元的数量和分布变化。

本实验采用健康成年SPF级老鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

1. 动物症状观察与野生型斑马鱼相比，斑马鱼幼体暴露于 MPTP 后，出现类似人类 PD 患者的行走不稳、反应迟缓、静止性震颤。PD 模型斑马鱼的游泳速度明显变缓，泳速和游泳持续时间明显减低，甚至静止时伴有身体抖动，对触及刺激反应迟缓且反应强度减低（图 1）。与临床症状相符。

2. 生物标志物方面：PD 的蛋白标志物 β-SYNUCLIN、PARKIN、PINK1 明4显高于正常对照斑马鱼；神经元细胞标志物酪氨酸羟化酶蛋白(TH)明显减少，提示多巴胺能神经元细胞死亡数增多（图 1）。

3. 多巴胺能神经元细胞数量明显减少。但，神经元细胞内 th 基因表达强度增强，类似于人 PD 早期脑多巴胺神经元死亡后存活神经元的代偿性 TH 高表达。（图 2）

 

图1. MPTP造成斑马鱼幼体运动减少，PD标志基因/蛋白水平升高斑马鱼幼体(5 dpf)暴露于50 µM的MPTP中24小时，进行运动活性（运动距离、持续时间和速度）检测20分钟。A．散点图显示幼体运动行为的统计学变化；右侧显示一组代表性运动轨迹图(5分钟轨迹)。B–E, 斑马鱼暴露于100和200 µMMPTP 24小时后，检测PD相关的标志基因和蛋白: TH (B)、β-syn (C)、Parkin (D)和PINK1 (E)。*, p values_0.05; **, p values_0.01; ***, p values_0.001。(one-wayANOVA)。

 

图 2. MPTP 导致斑马鱼幼体中脑多巴胺能神经元数量减少A. 以酪氨酸羟化酶基因(th)反义 RNA 为探针，采用原位杂交方法检测斑马鱼幼体中脑多巴胺神经元数量和 th 基因表达强度。B. 原位荧光免疫实验检测酪氨酸羟化酶，绿色荧光斑点显示斑马鱼幼体中脑多巴胺神经元数量和分布。一抗抗体为酪氨酸羟化酶抗体。