先天免疫缺陷基因敲除斑马鱼模型

1．中性粒细胞的形态及生化特征

原始中性粒细胞的发育首先由髓系祖细胞经谱系决定，发育成粒细胞前体细胞，再由粒细胞前体细胞经过增殖，分化和成熟形成有功能的中性粒细胞。在斑马鱼中，区分中性粒细胞可通过以下形态学与细胞学方法[1,2]：（1）成熟的中性粒细胞最显著的形态学特征为含有分叶核以及大量颗粒的细胞质，可以在循环系统以及结缔组织中被很清晰地辨认。（2）还可以通过分子标记来分辨不同成熟时期的中性粒细胞。已经有研究报道的粒细胞特异分子标记有转录因子C/ebp1，粒细胞颗粒中含有的髓过氧化物酶（Mpx）、溶菌酶C（Lyz）等。（3）另外，还可通过检测细胞的激活、趋化、变形运动能力、及吞噬、杀菌作用来辨别。（4）此外中性粒细胞可被苏丹黑B（Sudanblack B，SB）特异性染色，并且可根据染色程度来辨别不同分化过程的中性粒细胞。

2．中性粒细胞与病原菌感染

中性粒细胞是一种具有多形核的白细胞，是人体固有免疫中的重要组成成分，在机体抵抗病原菌感染时起着重要的作用。中性粒细胞在体内含量丰富，大约占人体白细胞总数的40%-75%[3]，并且在机体遭受病原菌感染时，中性粒细胞能够迅速的从血管中迁移到感染部位[4]。当中性粒细胞到达感染处后，主要通过两种方式来抵抗感染，一种是分泌大量的细胞因子和趋化因子，比如IL-1b[5], IL-18[6], LL-37[7] ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 等，这些小分子能够招募和激活更多的中性粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞到达感染部位，共同抵抗感染。另一方面，中性粒细胞还能够直接吞噬和消化病原菌，这主要依赖于斑马鱼中性粒细胞中含有丰富的颗粒酶。中性粒细胞内含有多种颗粒，这些颗粒富含各种杀菌作用的蛋白，并且在终末分化完成之前各种富含不同组分的颗粒必须组装完成（如图1所示）。中性粒细胞中三种颗粒分别是（1）嗜天青颗粒：又称初级颗粒，在早幼粒细胞中数量最多，颗粒中含有髓过氧化物酶、溶菌酶及较多的水解酶。（2）特异颗粒：又称次级颗粒，其中含有乳铁蛋白、溶菌酶等，颗粒膜上有多种CD抗原和受体。（3）白明胶酶颗粒：含白明胶酶、溶菌酶[8]。这些颗粒主要通过两种方式来杀灭病原菌。一种是氧依赖性杀菌途径，主要通过激活膜结合成分NADPH系统，产生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）来直接氧化并杀死病原菌[9]；另一种方式是通过氧非依赖性方式来消化破坏病原菌的细胞膜或壁结构的完整性[10,11]，从而通过使病原菌失去渗透压而死亡。但是目前对这些颗粒酶的研究大多数是在体外实验进行的，大部分颗粒酶的体内功能是未知的。因此了解和研究这些颗粒酶的成分以及颗粒酶的功能有助于研发新的抗菌酶。

3．斑马鱼Npsn蛋白的简介

Npsn最早在鲤鱼（Cyprinus carpio）的淋系造血组织中发现，属于虾红素蛋白家族（astacinfamily）的一员，并且具有肽链内切酶活性[13]。虾红素蛋白家族属于金属锌蛋白酶超家族的一员，在蛋白质消化、个体背腹轴确定以及形态发生中起着重要的作用[14]。研究者通过对比鲤鱼的Npsn的蛋白序列与其他物种的同蛋白家族酶的相似性，发现Npsn与medaka的孵化酶有大于50%的序列相似性，但是作者并没有在鲤鱼的孵化液中检测到Npsn的存在，所以作者猜测Npsn可能没有孵化酶的活性。而关于Npsn的另一个研究是在斑马鱼中进行的，作者通过分析斑马鱼造血组织的ESTs序列以及整体原位杂交（Whole-mount In Situ Hybridization, WISH）实验，发现了三个新的特异性表达在斑马鱼血管以及造血组织中的基因，Npsn就是其中的一个[15]。并且作者通过双色原位杂交进一步发现Npsn可能表达在斑马鱼的中性粒细胞中。根据以上前人的研究，我们猜测，Npsn可能是斑马鱼中性粒细胞中的一种颗粒酶，然而 Npsn在中性粒细胞中的作用，以及是否参与到宿主先天免疫至今尚未有研究。

4．斑马鱼在作为研究中性粒细胞颗粒酶功能的模式生物中的优越性

近几十年来，斑马鱼逐渐成为一种强大的工具来研究感染类疾病，除了斑马鱼的传统优势外，在研究中性粒细胞和病原菌的相互关系中具有独特的优势。首先，斑马鱼中性粒细胞的发育过程是保守的，都是起源于造血干细胞，通过早幼粒、中幼粒最终发育成为成熟的带有分页核的粒细胞[12]。其次，斑马鱼中成熟的转基因技术可以用荧光蛋白标记中性粒细胞，进而在活体实时观察中性粒细胞对病原菌的响应以及吞噬病原菌的过程[16]。第三，利用微分干涉相差显微镜显微镜（DIC）可以清晰看到中性粒细胞所含的颗粒酶，以及颗粒酶的发育过程。

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实验动物：野生型AB品系斑马鱼，养殖温度为28.5℃。

1.斑马鱼npsn的基因信息以及Cas9靶位点的确立

根据Ensembl数据库信息，npsn位于斑马鱼第7号染色体上，含有4个转录本，其中3个转录本npsn-001、-002和-003可以编码蛋白质，转录本npsn-004不可以编码蛋白。我们通过对各个编码蛋白转录本的cDNA序列比对，发现三个转录本的编码序列（coding sequence，CDS）大体相同，起始密码子的位置都位于外显子2上，由于剪切方式的不同产生了不同的终止子。

根据npsn各转录本编码蛋白的共有序列以及Npsn蛋白的功能域预测，我们在npsn基因外显子5和外显子6上选取npsn-Cas9的靶位点。其中在npsn-exon5上选取的Cas9靶位点序列为5’-GGAGACATCGCCTTTCCCAG-3’，在npsn-exon6上选取的Cas9靶位点序列为5’-GGTCAGGTCGTGTCTCTCCAG-3’。

2. 用于CRISPER/Cas9敲除实验斑马鱼的准备及靶位点SNP的检测

首先挑选20对3 - 5月龄体型正常的AB野生型斑马鱼，并且每个Cas9靶位点预准备10对斑马鱼进行Cas9靶位点处是否存在SNP的检测。我们首先在每个Cas9靶位点附近设计PCR引物

其中在npsn-exon5-Cas9处设计引物序列为：

F: 5’-GGACAGTGCTATTGCGTTTGG-3’，

R: 5’-GCCTTGTTCAATCACTGCTACTTC-3’，PCR产物长度为435 bp；

在npsn-exon6-Cas9处引物序列为：

F: 5’-TGCATTTTCTGTCATTTTCCTGTG-3’，

R: 5’-TGTTCTGATAGAGGATCCGGATG-3’，PCR产物长度为267 bp。

用眼科剪剪取少量斑马鱼尾鳍组织，先加入20 uL碱液（25 mM NaOH+ 200μM的EDTA（~ PH 12）），将样品置于95 ℃水浴锅中裂解30分钟，在振荡器上震碎组织，然后加入等体积的中和液40 mM的中和液（TRIS-HCL(~ PH 5)），离心，取上清液作为PCR反应中的DNA模板。PCR反应体系与反应条件如下：

PCR反应结束后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小是否正确以及条带是否特异。若PCR产物大小正确，并且条带特异，可以将PCR产物送去公司进行测序。根据测序结果，将PCR产物中有SNP的斑马鱼舍弃，留下无SNP的亲本进行下步npsn-Cas9敲除实验。同时送公司合成用于gRNA的制备的长片段引物FP（oligo），

其中npsn-exon5 oligo的序列为：

5’-TAATACGACTCACTATAggagacatcgcctttcccagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’（T7启动子序列 + Cas9靶位点序列 + gRNA - FP）；

npsn-exon6 oligo的序列为：

5’- TAATACGACTCACTATAggtcaggtcgtgtctctccagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’。

3. Cas9 mRNA以及gRNA的制备

3.1 Cas9 mRNA的合成

1）pSP6-2sNLS-spCas9 载体的线性化：

10X CutSmart® Buffer：5 uL

Xba I： 1 uL

DNA (pSP6-2sNLS-spCas9)： 2 ug

ddH2O： up to 50 uL

37 ℃孵育4小时，取少量酶切产物电泳确定是否线性化完全，然后直接回收线性化产物。

2）体外转录合成Cas9 mRNA：

按照SP6体外转录试剂盒（Ambion，AM1340）的说明进行体外转录。转录结束后，利用微量分光光度计检测合成的Cas9 mRNA的浓度，然后将mRNA稀释成600 ng/uL，并且分装后于- 80 ℃冰箱长期保存。

3.2 gRNA的制备

1）gRNA DNA模板的制备：

取5 uL PCR产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳来分析目的条带是否单一，并且将PCR产物纯化回收，用微量分光光度计分析回收产物的浓度，此DNA片段作为下步gRNA体外转录的模板。

2）gRNA的体外转录合成：

表1-2-3. 体外转录体系

Tab.1-2-3 in vitro transcription system

反应体系混匀后，置于37 ℃孵育4 - 5小时。加入2 uL DNase I消化去除DNA模板，并且取1 uL反应液进行1 %琼脂糖凝胶电泳，检测模板DNA是否消化完全，以及大体估测产物gRNA的浓度。

3）gRNA的纯化：

转录体系（20 uL）每管加500 uL TRIzol 试剂，震荡混匀；

加100 uL三氯甲烷，手动摇晃15 s，常温静置3 min；

12000 X g，4度，离心15分钟，取上清于新的EP管中；

加入等体积的异丙醇溶液，震荡混匀，静置10 min；

12000 X g，4度，离心10分钟，去上清液，留沉淀；

向沉淀中加入1 mL的75 %的乙醇(溶于DEPC处理过的H2O)，震荡混匀；

12000 X g，4度，离心5分钟，去上清液，留沉淀；

待乙醇挥发干净，加入5 uL的DEPC处理过的H2O；

用微量分光光度计测RNA的浓度，琼脂糖凝胶电泳，以及稀释成不同浓度的RNA用于显微注射，剩余RNA储液置于- 80 ℃冰箱内长期保存。

3.3显微注射

将Cas9mRNA（300 ng/ul）和gRNA（不同浓度梯度）按照体积比1 : 1混合，通过显微注射方式注射入单细胞时期（出生后半小时内）的斑马鱼鱼卵中，液滴体积大小大约为0.5 nL。显微注射后，更换新鲜的胚胎培养液。并且待胚胎发育至原肠胚时期，用吸管吸走死亡的胚胎，将存活的胚胎再次更换新鲜的胚胎培养液。

3.4 Cas9靶位点效率的检测

采用T7 核酸内切酶 I酶切法检测Cas9靶位点的效率，T7 核酸内切酶 I 可以识别并切割不完全配对 DNA、十字型结构 DNA、Holliday 结构或交叉 DNA、异源双链DNA 或者以更慢的速度切割或切刻双链 DNA，因此常用于突变体的检测。具体如下：

取20颗大约24 hpf的小鱼胚胎分别放置于96孔PCR板中，并且取4颗AB野生型胚胎作为对照组。吸干胚胎培养液，每孔加入20 uL的组织裂解液，样品置于95 ℃水浴锅内裂解30分钟，在振荡器上震碎组织，然后加入等体积的中和液，离心，取上清液作为PCR模板。PCR反应条件如下：

扩增PCR产物利用DNA琼脂糖凝胶电泳检测产物的特异性，将剩余的PCR产物置于98 ℃水浴锅中水浴10分钟（充分打开DNA的二级结构），使其缓慢将至室温，然后进行T7 核酸内切酶 I酶切反应，酶切体系如下：

10 X NEB Buffer 2.1： 1 uL

PCR 产物： 4uL

T7E1酶:0.2 uL

ddH2O：up to 10 uL

37 ℃孵育2小时，电泳，确定条带是否被切开，其中前20孔样品是打了Cas9的实验组，后四个样品为AB对照组。

npsn-exon5-Cas9的PCR产物大小为435 bp，对照组未被切开，进一步说明了在此片段中不存在SNP，而实验组有部分DNA被切成220 bp左右的片段，这说明Cas9 mRNA在靶点处进行了切割，并且产生了突变，并且根据DNA电泳条带的亮度估测此位点的突变效率大约70 %。

npsn-exon6-Cas9的PCR产物大小为267 bp，对照组未被切开，进一步说明了在此片段中不存在SNP，而实验组有部分DNA被切成150 bp和120 bp的DNA片段，这说明Cas9 mRNA在靶点处进行了切割，并且产生了突变，并且根据DNA电泳条带的亮度估测此位点的突变效率大约50 %。

4. 斑马鱼组织DNA的粗提。

1）将50 X的组织裂解液稀释成1 X的工作液（吸取200 uL 50 X组织裂解液，加入去离子水稀释到10 mL溶液）；将50 X的中和液稀释成1 X的工作液（吸取200 uL 50 X中和液，加入去离子水稀释到10 mL溶液）

2）用吸管吸取斑马鱼胚胎于EP管中，并且用小量程的枪小心吸走多余液体，加入20 uL组织裂解液；

3）将EP管放入95 ℃水浴锅内裂解30分钟；

4）震荡EP管，使组织充分裂解；

5）向EP管中加入相同体积的中和液，震荡混匀并且离心；

6）吸取上清液即可作为PCR反应的模板。

5．npsn缺陷斑马鱼模型构建结果检测

我们设计Cas9靶点在npsn的exon5和exon6上，其中npsn-exon5-Cas9靶点获得（-7，+0）突变体（称为npsnsmu5）（如图5 A所示），在npsn-exon6-Cas9靶点获得（-0，+1）突变体（称为npsnsmu6）（如图5 B所示）。npsnsmu5和npsnsmu6的纯合突变体形态正常，能够存活至成年，并且正常的进行繁殖。

6．突变体中npsn mRNA表达变化检测

为了检测突变体中npsn mRNA的表达是否发生改变，我们利用npsn的整体原位杂交技术检测npsnsmu5突变体中npsn mRNA的表达。结果显示，在npsnsmu5突变体中，npsn信号点几乎检测不到（如图6 A所示），在npsnsmu6突变体中同样出现npsn信号点的缺失。为了检测npsnsmu5突变体中npsn是发生了部分降解还是全面降解，我们在突变位点的前面、后面以及包含突变点处分别设计qPCR的引物，经qRT-PCR检测发现，npsnsmu5中npsn的表达都下降到原来的5 %左右（如图6 B所示），这说明npsnsmu5突变体中npsn mRNA发生了全面降解，这种降解可能是由于无义突变介导mRNA降解（nonsense-mediated decay, NMD）引起的。

A. 3 dpf npsnsmu5突变体和同胞的npsn整体原位杂交。B. qRT-PCR检测npsnsmu5突变体和同胞中npsn表达量的变化。

1．npsnsmu5突变体中中性粒细胞的数量没有明显改变

为了验证npsnsmu5突变体中npsn表达量的减少是由于每个中性粒细胞中npsn表达量下降，还是由于中性粒细胞的数量减少，我们利用斑马鱼整体原位杂交技术检测中性粒细胞的其他标记物mpx和lyz的表达是否发生改变。结果表明，在npsnsmu5 突变体内lyz和mpx信号点并没有明显变化（如图7 A, B, A’和B’所示），并且我们通过SB染色方法(主要染的中性粒细胞中脂质颗粒)，发现SB信号点的数量也没有明显变化（如图7 C和C’所示）。在微分干涉显微镜（differential interference contrast microscope，DIC)下观察中性粒细胞的颗粒，同样没有发现npsnsmu5 突变体与野生型斑马鱼有明显的改变。以上结果表明，npsnsmu5突变体中中性粒细胞的数量没有明显改变。

（A和A’）.lyz整体原位杂交和PBI区lyz+细胞数量统计。（B和B’）.mpx整体原位杂交和PBI区mpx+细胞数量统计。（C和C’）.SB染色和SB+信号点的统计。

2．npsn缺陷导致斑马鱼抵抗E.coli感染的能力下降。

中性粒细胞在抵抗细菌感染中起着不可或缺的作用。为了检测斑马鱼在敲除npsn后是否影响斑马鱼抵抗细菌感染的能力。我们分别在野生型斑马鱼组和npsnsmu5突变体组分别在卵黄囊处感染大肠杆菌。为了摸索一个合适的大肠杆菌感染浓度，我们分别在野生型斑马鱼组打入10、100和1000 CFUs的菌落，发现10 CFUs菌就可以导致斑马鱼的感染死亡，并且随着感染大肠杆菌菌量的增加，斑马鱼的死亡率逐渐升高，并且感染10和100 CFUs大肠杆菌时从2 dpi开始死亡，而感染1000 CFUs大肠杆菌时，第一天就会出现死亡（如图8 A所示）。由于100 CFUs的大肠杆菌菌量能够使野生型斑马鱼的存活率在40 %-60 %之间，因此100 CFUs的大肠杆菌菌量作为本研究所使用的感染菌量。当野生型斑马鱼和npsnsmu5突变体同时感染大肠杆菌后，在1 dpi所有的胚胎都正常存活，在2 - 3 dpi鱼体开始出现死亡，并且npsnsmu5突变体的存活率比野生型对照组显著下降，在4 - 5 dpi时，有些胚胎存活下来，同时也没有出现明显感染的表型，这说明大肠杆菌在这些胚胎内的生长成功被抑制（如图8 B所示）。以上结果表明，npsn缺陷导致斑马鱼抵抗E.coli感染的能力下降。

A.野生型斑马鱼感染不同浓度的大肠杆菌后的生存曲线。B.野生型斑马鱼和npsnsmu5突变体斑马鱼

为了进一步确定Npsn在斑马鱼抵抗大肠杆菌感染中的作用，我们在npsn mRNA的起始转录点ATG附近设计了吗啉代（morpholino）片段（npsn-ATG-morpholino），吗啉代是一种被修饰过的可以抵抗核酸酶消化的反义寡核苷酸[88]，能够行使干扰基因功能或者阻断RNA翻译的起始或者阻碍RNA的剪切。为了验证npsn-ATG-morpholino是否可以干扰npsn基因翻译的起始，我们首先体外合成了npsn-ATG-morpholino互补片段（complementation）（DNA模板片段如图9 A所示），后面连接EGFP的序列的RNA片段，然后和npsn-ATG-morpholino一起通过显微注射技术注射到斑马鱼单细胞的胚胎中，在荧光显微镜下观察是否有绿色荧光出现。结果显示，在注射npsn-ATG-morpholino(complementation)-EGFP的RNA序列的对照组，可以观察到绿色荧光的表达，而注射npsn-ATG-morpholino(complementation)-EGFP和npsn-ATG-morpholino混合物组未出现绿色荧光的表达（如图9 B所示），说明npsn-ATG-morpholino序列可以有效阻止npsn转录的起始。然后我们注射该morpholino片段和野生型斑马鱼同时感染大肠杆菌，结果显示，相对于野生型斑马鱼，注射npsn-ATG-morpholino组斑马鱼的存活率显著下降，这说明敲低斑马鱼npsn的表达，使斑马鱼抵抗大肠杆菌感染的能力下降（如图9 C所示）,这与npsnsmu5突变体在感染大肠杆菌后的表型相似。以上结果进一步证明，斑马鱼npsn缺陷能够导致斑马鱼抵抗大肠杆菌感染的能力下降。

A.用于体外转录npsn-ATG-morpholino(complementation)-EGFPRNA的DNA片段的模式图；B. npsn-ATG-morpholino的效率检测；C. 野生型斑马鱼和注射npsn-ATG-morpholino斑马鱼同时感染大肠杆菌后的生存曲线。log-rank test，*** p＜0.001，n＞60。

3．npsn缺陷导致斑马鱼感染后体内残余大肠杆菌量增加

我们检测了大肠杆菌菌群在npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼体内增殖的数量，发现在感染大肠杆菌后两天，在npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼中大肠杆菌的数量都有所上升，并且在大肠杆菌在npsnsmu5突变体中增殖的速度比较快，导致在1 dpi（days post infection）和2 dpi，npsnsmu5突变体斑马鱼体内残留更多的大肠杆菌（如图10所示）。这说明npsn缺陷影响了斑马鱼中性粒细胞有效控制大肠杆菌感染的能力，使大肠杆菌在体内繁殖的更快，进而引发了更严重的感染。

4．npsn缺陷导致斑马鱼感染大肠杆菌后早期炎性因子水平显著升高。

体内炎症因子水平是判断体内炎症反应的重要指标之一，因此我们利用qRT-PCR技术，检测了在大肠杆菌感染早期相关炎性因子和趋化因子的表达水平。il-1β（interleukin-1 beta, IL-1β）、tnf-α（Tumor Necrosis Factor a）和tnf-β（Tumor Necrosis Factor β）是重要的炎性因子，正常情况下在体内的表达量很低，在机体遭受到感染时，其表达量迅速上升。我们发现在早期感染中，il-1b、 tnf-a和tnf-β表达都显著上升，并且npsnsmu5突变体中的表达水平比野生型斑马鱼显著升高。il-8（interleukin-8, IL-8）是相对下游基因，并且对中性粒细胞的募集起着重要的作用。我们发现，il-8的表达量与il-1b、tnf-a和tnf-β表达趋势一致，在npsnsmu5突变体中的表达量也比野生型对照组中显著升高（如图11所示）。以上结果表明，斑马鱼npsn缺陷可以导致斑马鱼体内的炎症反应更为强烈。

5. npsn的过表达增强了针对大肠杆菌感染的宿主免疫反应

为了评估Npsn是否增强了E.coli的清除，我们将融合了6Myc标签并由hsp启动子驱动的Npsn编码序列克隆到Tol2载体中（称为作为pTol2-hsp-Myc-npsn）。将该构建体注射到单细胞阶段的WT胚胎中，并通过抗Myc染色鉴定F0的后代。选择F1Mycþ胚胎，并标记为Tg（hsp：Myc-npsn）品系。随后将Tg（hsp：Myc-npsn）和WT胚胎感染大肠杆菌，并置于热激条件下，然后记录存活率。我们的发现表明，相对于WT变体，Tg（hsp：Mycnpsn）系表现出明显更高的存活率（图12），这表明npsn的过表达增强了斑马鱼胚胎中宿主对大肠杆菌感染的免疫反应。

当我们测量与感染的胚胎的体内细菌生长相关的动力学曲线时，我们发现在1和2 dpi时，Tg(hsp：Myc-npsn)胚胎中的细菌负荷显着低于野生型胚胎。数据显示，大肠杆菌在npsn过表达的胚胎中增殖较慢，这表明npsn过表达可以增强宿主抵抗斑马鱼胚胎中大肠杆菌感染的防御能力.在Tg(hsp：Myc-npsn)胚胎中，炎症因子（tnfa，il-8和il-1b）的表达低于野生型对照（图13f），表明npsn过表达的胚胎中炎症的减轻。此外，过表达npsn可以挽救npsnsmu5突变体胚胎中改变的炎症反应（图13g），这表明Npsn在宿主抵抗细菌的防御中很重要。

f. 2 hpi时Tg(hsp:Mycnpsn)胚胎中炎症反应的变化。g. npsn过表达可挽救炎性细胞因子表达的改变

动物模型的制备和应用实验必须在具备相应资质的实验室开展。动物模型的制备、应用过程中的监督管理、处置措施、对环境和生态影响等应符合国家相关法律规定。

为了研究Npsn在斑马鱼中性粒细胞中的功能，我们运用CRISPER/Cas9技术对斑马鱼npsn进行全基因组敲除，并且获得了一系列npsn基因发生移码突变的突变体斑马鱼，比如在exon5-Cas9靶点获得的（-7，+0）（npsnsmu5）突变体，和在exon6-Cas9靶点处获得的（-0，+1）（npsnsmu6）突变体，并且经预测它们的蛋白结构相对于野生型斑马鱼出现移码突变和提前终止。但是我们通过WISH检测发现在npsnsmu5突变体斑马鱼中，npsn的信号几乎是缺失的，并且qRT-PCR结果也同样证明了在npsnsmu5突变体中npsn的mRNA水平下降到野生型斑马鱼的5%左右，可能是由npsn的无义突变导致了mRNA的全面降解所导致的。但是npsnsmu5纯合突变体胚胎能够正常存活到成年，大小和体型正常，并且是可以正常的产生后代。

为了研究Npsn缺陷是否影响斑马鱼中性粒细胞的发育，我们通过斑马鱼中性粒细胞特异性标记基因mpx和lyz的整体原位杂交，发现npsnsmu5突变体和野生型斑马对比，mpx+和lyz+信号点的数量没有明显差别。苏丹黑染色也同样发现SB+阳性细胞的数量也没有差异。并且进一步在DIC下观察npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼中性粒细胞中的颗粒，也未发现明显区别。以上结果表明，Npsn缺陷并不显著影响斑马鱼中性粒细胞的发育和数量。这可能是因为Npsn只是斑马鱼中性粒细胞中的一种酶颗粒，缺失后并不影响中性粒细胞的发育，但是可能影响了中性粒细胞的某些功能。

为了研究Npsn缺陷对斑马鱼中性粒细胞功能的影响，而中性粒细胞的主要功能是参与机体的固有免疫反应，因此我们做了斑马鱼大肠杆菌的侵染实验。我们利用显微注射的方式感染npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼胚胎的卵黄囊，通过记录并比较感染后两者的生存率，发现npsnsmu5突变体在感染大肠杆菌后生存率相对于野生型胚胎显著下降，体内残余的菌量明显上升，并且在感染的早期阶段，npsnsmu5突变体中炎性因子的表达水平比野生型明显升高，这说明了中性粒细胞在抵抗细菌感染中存在功能缺陷。为了进一步验证Npsn在中性粒细胞抵抗感染中的作用，我们通过构建斑马鱼Npsn过表达的转基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同时感染大肠杆菌，发现Npsn过表达后能显著提高感染后斑马鱼的存活率。这个结果进一步表明，斑马鱼Npsn有助于斑马鱼抵抗细菌感染。

但是Npsn通过哪种方式来帮助中性粒细胞抵抗感染的呢？先前有体外实验证明，鲤鱼的Npsn能够水解纤连蛋白和明胶，而这两种组分又是细胞外基质的重要成分，那么Npsn是否通过影响斑马鱼中性粒细胞的迁移来影响对大肠杆菌的抵抗的呢？为了验证这个观点，我们观察了在感染后4小时时伤口处中性粒细胞的数量，但是比较npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼并没有发现明显差异。另外，Npsn作为一种水解酶，它能否能够直接水解和破坏大肠杆菌细胞的完整性，进而影响大肠杆菌在机体内存活的呢？并且Npsn缺陷主要影响斑马鱼清除哪种类型的菌呢？为了验证这些问题，我们也将npsnsmu5突变体斑马鱼和野生型斑马鱼同时感染了其他类型的菌，如革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌等，发现Npsn缺陷后可能增加斑马鱼对革兰氏阴性菌的敏感性。但是Npsn影响斑马鱼中性粒细胞抵抗细菌感染的具体机制，还需要更多的实验来验证。另外npsnsmu5突变体可以作为斑马鱼免疫与炎症反应模型，对研究在感染过程中，中性粒细胞与病原菌的相互关系，以及对研发新的抗菌药物具有重要的指导意义。