慢性粒细胞白血病转基因斑马鱼模型

白血病（leukemia）是临床上常见的恶性克隆性血液肿瘤，是国内十大高发恶性肿瘤之一，其中慢性白血病常见有慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）。CML特征是有功能的已分化成熟细胞过度增生, 是一种起源于多能造血干细胞的恶性血液病，患者白血病细胞中可发现BCR/ABL1融合基因，即费城染色体。BCR/ABL1介导的费城染色体畸变被认为是CML的始动突变。CML可以向髓系和淋巴系急变，急变期对各种治疗手段反应差，预后不佳。现时期，耐药已成为治疗CML的重要难题，且已有的小鼠及细胞CML模型在机制研究和药物筛选中尚存不足。因此，利用斑马鱼独特的生物学优势构建斑马鱼CML疾病模型，以及利用该模型构建药物筛选平台具有独特的优势，有望利用该模型筛选出安全可用、有显著疗效、治疗效果稳定的治疗CML的药物，对现时解决CML机制研究瓶颈、解决CML耐药性以及预后不良等问题具有重要意义。

方法简介

在本研究中我们使用了野生型AB品系斑马鱼，把BCR/ABL1融合基因克隆到具有hsp70启动子序列的pTol2载体，通过显微注射建立稳定遗传的Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)转基因斑马鱼系。利用该转基因品系斑马鱼，关于该转基因品系斑马鱼CML表型鉴定，通过热激处理后，观察斑马鱼幼年与成年时期造血系统中各血细胞各谱系细胞数量以及细胞形态变化。我们发现相对于对照组，Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)转基因斑马鱼系表现为髓系细胞增多，与临床上CML血液表型主要表现为粒系增生趋势一致，同时单核/巨噬细胞、淋巴细胞和血小板这几类细胞中的一类或多类细胞增多，与MPN血液表型类似。关于缓解该转基因斑马鱼品系表型的药物筛选处理，按照热激处理-给药处理的顺序处理斑马鱼胚胎，观察幼年时期斑马鱼造血系统各血细胞谱系细胞数量变化。我们发现，相对于对照组，TKIs可缓解Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)转基因斑马鱼胚胎期的异常造血。

图1.pToL hsp70: p210BCR/ABL1质粒结构与Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)品系证实

Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)转基因斑马鱼是利用已构建好的含hsp70启动子以及BCR/ABL1的质粒和Tol2转座系统，通过显微注射技术于斑马鱼单细胞时期将完整的编码序列整合到宿主基因组中，从而产生该转基因斑马鱼品系。 转基因斑马鱼的Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)通过PCR得到证实。

图2.Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)转基因斑马鱼BCR/ABL融合基因表达情况

在Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)转基因斑马鱼系中，通过热激诱导BCR/ABL融合基因表达，BCR/ABL融合基因在mRNA和蛋白质各水平表达于该转基因斑马鱼品系幼年时期显著上调。说明该转基因品系斑马鱼通过热激处理可以使BCR/ABL融合基因稳定地强表达。

图3.Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)转基因斑马鱼幼年时期髓系细胞发育

在Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)转基因斑马鱼系（斑马鱼CML模型）中，通过髓系细胞、红系细胞、淋巴系细胞特异标记基因l-plastin（lcp）、lyz、mfap4、整胚原位杂交实验，以及SB细胞化学染色实验结果得知，p210BCR/ABL在斑马鱼体内表达可诱导l-plastin+整体髓系细胞数目增多，lyz+中性粒粒细胞数目增多、mfap4+巨噬细胞增多，但增多的巨噬细胞功能存在缺陷。p210BCR/ABL对Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)转基因斑马鱼胚胎造血的主要影响表现为髓系细胞增多。这与临床上CML血液表型主要表现为粒系增生趋势一致。

图4.Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)转基因斑马鱼成年时期的血液表型

通过瑞氏-吉姆萨细胞染色实验检测，斑马鱼CML模型成年时期血液表型主要表现为前体细胞、发育偏成熟的中性粒细胞（中幼粒、晚幼粒及成熟粒细胞）、单核/巨噬细胞、淋巴细胞和血小板这几类细胞中的一类或多类细胞增多，与MPN血液表型类似。

图5. TKIs可缓解Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)转基因斑马鱼胚胎期的异常造血

通过lcp整胚原位杂交实验可发现，在imatinib、dasatinib和bosutinib对热激诱导表达BCR/ABL的Tg(hsp70:p210BCR/AB1L)转基因斑马鱼胚胎中lcp+细胞数目相对安慰剂组明显减少。我们知道TKIs药物靶点为p210BCR/ABL激酶口袋结构域，可缓解酪氨激酶活性异常升高引起的各种异常的生物学活动。我们可以看到Tg(hsp70:p210BCR/ABL1)转基因斑马鱼胚胎中lcp+细胞数目相对安慰剂组明显减少，说明其对imatinib、dasatinib和bosutinib具有分子响应，在一定程度上说明了Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎造血异常的分子机制很有可能是由于p210BCR/ABL在Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎体内表达引起酪氨酸激酶异常增高，而异常调控造血干细胞发育所致。

综上，BCR/ABL1转基因斑马鱼成为首个人类CML疾病的斑马鱼模型。利用该模型将有望揭示CML疾病更为精准的发病机制及急变关键因子，阐明相关的信号通路，发现临床早期诊断、预后、治疗效果评价的分子标记物或靶向基因，以此可进行针对CML的斑马鱼活体高通量小分子筛选，Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼有望为治疗CML的新药筛选提供一个有价值的平台。