结核分枝杆菌感染树鼩模型

结核病是由结核分支杆菌（结核菌）引起的一种慢性传染性疾病，结核感染通常会累及肺、淋巴系统及其它多组织器官。除少数发病急促外，临床上多呈慢性过程。常有低热、乏力等全身症状和咳嗽、咯血等呼吸系统表现。感染后潜伏期4～8周，其中80%发生在肺部，其他部位（颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼）也可继发感染。

排菌的肺结核患者是传染源,人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式。大多数的受感染者没有病症，称为潜伏结核感染（latentTBinfection），但其中约5-10%的潜伏感染者会发展至活动性结核；若无适当治疗，一个活动病例平均每年可使10～15人新受感染，病例本人的死亡率则超过50%。若潜伏感染者同时罹患免疫抑制，如爱滋病，每年就有10%的病发机率。

肺结核病程较复杂，临床分型有：1、原发型肺结核(Ⅰ型):肺内渗出病变、淋巴管炎和肺门淋巴结肿大的哑铃状改变的原发综合征。儿童多见，仅表现为肺门和纵隔淋巴结肿大。 2、血型播散型肺结核(Ⅱ型):包括急性血型播散型肺结核及亚急性、慢性血型播散型肺结核。 3、继发型肺结核(Ⅲ型):可以出现以增殖为主、浸润为主、干酪病变为主或以空洞为主等多种病理改变。

结核菌进入机体后，被巨噬细胞吞噬，结核菌毒力与宿主免疫力的抗衡决定着结核发病、发展和转归。结核病从感染、发病到转归均与多数细菌性疾病有显著不同，宿主反应具有特殊意义，反应分为4期：1.起始期，入侵呼吸道的结核菌被肺泡巨噬细胞吞噬。因菌量、毒力和巨噬细胞非特异性杀菌能力的不同，被吞噬结核菌的命运各异。2. T细胞反应期，由T细胞介导的细胞免疫（CMI）和迟发性过敏反应（DTH）在此期形成，从而对结核病发病、演变及转归产生决定性影响。3.共生期，大部分感染者结核菌可以持续存活，细菌与宿主处于共生状态。纤维包裹的坏死灶干酪样中央部位被认为是结核杆菌持续存在的主要场所。低氧、低PH和抑制性脂肪酸的存在使细菌不能增殖。宿主的免疫机制亦是抑制细菌增殖的重要因素，倘若免疫损害便可引起受抑制结核菌的重新活动和增殖。4.细胞外增殖和传播期，固体干酪灶中包含具有生长能力、但不繁殖的结核菌。干酪灶一旦液化便给细菌增殖提供了理想环境。即使免疫功能健全的宿主，从液化干酪灶释放的大量结核杆菌亦足以突破局部免疫防御机制，引起播散。

结核病的全身症状是全身乏力、午后低热、盗汗、食欲不振、消瘦等；呼吸道症状是咳嗽、咳痰、咯血、胸疼、呼吸困难等。其特征性病理改变是肉芽肿病变和结核性结节，其基本病理变化为渗出性病变、增生性病变和坏死性病变。渗出性病变以炎症细胞、单核细胞肌纤维蛋白为主要成分，增殖性改变以结核结节及结合性肉芽肿为主，坏死的特征性改变为干酪样改变。结核性炎症的主要特是上皮样细胞结节及郎格汉斯细胞。实验室痰培养为菌阳性，抗酸染色可见细长略弯曲的杆菌，血沉加快。肺的原发病灶、淋巴管炎和肺门淋巴结结核合称为原发综合症，X线影像学上的典型表现为哑铃状阴影。感染3-8周后结核菌素皮试转阳，95%的健康感染者原发综合征自然消退，成为潜伏感染人群，约5%在日后因潜在感染复燃而发病,结核病起病缓慢，病程较长。

结核分支杆菌标准株H37Rv或耐药株（内部编号94789）经小鼠体内两次增毒，于罗氏斜面培养基培养，收获斜面培养3周的细菌经5μm无菌滤器( Millipore公司)制成单细胞菌悬液，经罗氏斜面培养基培养计数，单细胞悬液菌浓度为1× 107 CFU /ml，单细胞悬液分装冻存于－80℃低温冰箱备用。

中缅树鼩，1年龄，雄性，清洁级，体重100-170g，购自中国科学院昆明动物研究所。实验动物的使用得到了北京协和医学院中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用和管理委员会的批准（批准号ILAC-PC-2012-003），动物在感染前一周进入医学实验动物研究所生物安全3级实验室。

取树鼩固定于保定袋中，暴露股静脉，75%酒精擦拭消毒，静脉注射250μl结核分支杆菌H37Rv单细胞悬液，感染剂量为2.5× 106 CFU（高剂量组），将H37Rv单细胞悬液稀释1000倍，再静脉注射250μl，感染剂量为2.5× 103 CFU（低剂量组），高低剂量组各感染树鼩10只，4只为正常对照组，股静脉注射同等体积的生理盐水，所有实验均在医学实验动物研究所生物安全3级实验室（BSL-3）进行操作。

攻毒后每天观察树鼩活跃度，用红外线体温计监测树鼩体温，每周称量一次体重。

感染后5W高剂量组取4只（其中一只病重死亡，死亡后及时解剖），低剂量组取4只，正常对照组取4只，8W高、低剂量组各取3只，11W高剂量组取3只，低剂量组取3只腹腔注射2%戊巴比妥钠（剂量为40mg/Kg）麻醉后心脏采血处死；1.6ml血液放置血沉管中，轻柔颠倒混匀数次，垂直静置血沉架上30分钟后读取1小时血沉值，约1.5ml血液放置血常规管，轻柔颠倒混匀数次，用动物血细胞分析仪检测血常规；无菌取各组织，先后经过生理盐水、4%硫酸和生理盐水漂洗，进行组织病理分析、荷菌量检测、蛋白质谱分析和部分差异蛋白转录水平的分析。

将采集后的各组织用4%中性甲醛固定一周后，常规方法切片、HE染色，光学显微镜观察病理组织学变化。

无菌取各组织约50mg，漂洗后加1ml生理盐水用玻璃组织研磨器研磨，组织悬液经无菌生理盐水按照1：10稀释后取0.1ml接种罗氏斜面培养基，平行接种3管。以上2个浓度均置于37℃，5%CO2培养箱中培养4周后进行菌落计数。

病理组织片按常规方法脱蜡后染色，将脱蜡后的组织切片置于湿盒内，滴上抗酸初染液，90℃水浴5分钟后用细流水倾斜冲洗玻片至初染液洗掉后再滴上复染液脱色复染，直至玻片上的组织呈淡蓝色；镜检。

将高剂量组、低剂量组、正常对照组三组肺组织样品于沸水中5分钟灭活结核分支杆菌。送公司进行蛋白样品的裂解、浓度测定，蛋白酶解后用iTRAQ标记各组肽段混合，用SCX柱进行液相分离。基于Triple TOF 5600进行LC-ESI-MS/MS质谱分析。基于NCBI树鼩核酸序列数据库（50461 sequences），利用蛋白质鉴定软件Mascot2.3.02进行检索，选择已经建好的数据库，进行数据库的搜索，并对质谱质量进行评估。获得的数据进行蛋白质生物信息学分析，包括差异蛋白的筛选，进行GO、COG注释，差异蛋白GeneOntology富集分析、pathway富集分析，以及多样品间表达模式聚类分析。随机选取部分差异蛋白，用SYBR-Green的荧光定量PCR进行转录水平的分子验证。即从ITRAQ筛选的差异表达基因中选择一部分与结核感染相关的基因进行qRT-PCR验证。

1体温、体重、活跃度、血液学变化

各组体温无明显改变，低剂量组各时间段体重变化无明显规律，活跃度改变不明显，高剂量组1只感染后第五周病重死亡，体重降低51.52g，1只感染后八周活跃度明显降低，体重下降40.74g，余体重变化无明显规律，活跃度改变不明显。

血常规检查：高、低剂量组间血常规无明显变化，两组红细胞计数、血小板计数、血红蛋白含量无明显变化，白细胞总数升高，淋巴细胞比例多数增高。各组血沉均<5mm/h。

2 组织荷菌量

组织匀浆细菌培养高、低剂量组间无显著性差异，各组可见肺、肝、脾、肾、唾液腺、回肠、生殖器均有结核分支杆菌菌落生长。

3 组织切片抗酸染色

4病理改变

4.1大体病理改变

如图3.1所示，感染后五周高剂量组病重死亡一只，体型明显消瘦，死亡后及时解剖,胃肠组织有自溶现象，皮下、肋间隙、膈肌、后腹膜可见1-5mm大小不一的结节，肾脏肉眼可见灰白色病灶。高剂量组感染后5W、8W共有4只，低剂量组感染后8W1只静脉注射部位有皮肤溃疡。2只高剂量组感染后8W、11W胸腔积液约1ml，1只高剂量组感染后11W头部皮下有脓肿。高剂量组各时间段肺组织肉眼均可见结节状病灶。

4.2组织病理改变

低剂量组各时间段组织病理无特异性改变。

如图3.2所示，高剂量组感染后5W病重死亡的一只脾脏内可见肉芽肿,周围炎细胞浸润；肝脏内炎细胞浸润；左肺及右肺可见多个界限清楚的实变灶，中央坏死，周围炎细胞浸润；肾间质内灶性炎细胞浸润；肾上腺灶性坏死，炎细胞浸润，被膜炎细胞浸润；真皮及皮下组织灶性坏死，炎细胞浸润；肌肉组织灶性坏死，炎细胞浸润（脓肿形成）；感染后5W其余动物肺组织未见特异性改变。感染后8W、11W肺组织可见大面积坏死，可见结节，结节中央坏死，周围大量炎细胞浸润。各时间段可见肝脏内小灶性炎细胞浸润，肾组织内灶性炎细胞浸润。出现皮肤溃疡的动物，取溃疡皮肤病检，可见真皮及皮下组织出血坏死，炎细胞浸润，肌肉组织大片坏死，炎细胞浸润。感染后8W活动度明显减少的动物，除上述肺组织特异性的改变，另可见小脑组织灶性坏死，周围少量炎细胞浸润。

5蛋白质谱

为了分析结核分支杆菌感染树鼩肺组织中蛋白质表达变化，分别取高、低剂量组感染的树鼩肺组织和正常对照组的肺组织，利用蛋白裂解液裂解后，通过iTRAQ定量质谱方法分析差异蛋白，在相对定量时，如果同一个蛋白质的量在两个样品间没有显著的变化，那么其蛋白质丰度比接近于1。当蛋白的丰度比即差异倍数达到1.5倍以上或小于0.67倍，且经统计检验其P-value值小于0.05时，视该蛋白为不同样品间的差异蛋白。高剂量组（TH-A）与低剂量组（TH-B）相比筛选到的上调蛋白和下调蛋白分别为144和76个；高剂量组（TH-A）与正常对照组（TH-C）相比筛选到的上调蛋白和下调蛋白分别为134和53个；低剂量组（TH-B）与正常对照组（TH-C）相比筛选到的上调蛋白和下调蛋白分别为9和20个。高剂量组的部分表达上调的差异蛋白可能与结核感染相关，而在人类中，这些蛋白已证实与结核感染密切相关，如表3.1所示。将差异蛋白在KEGG（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes）数据库中进行比对，以人类相关蛋白为对照，差异蛋白参与的信号通路如下：肌动蛋白细胞骨架、吞噬、钙离子信号通路、Jak-STAT信号通路、抗原加工及呈递、CD45/MAPK信号通路、自噬通路，这些信号通路都与结核分支杆菌感染相关，如图3.3所示。然而，一些已证实与结核感染有关的固有免疫相关的信号通路并未在感染结核的树鼩模型中发现，如：Toll-like受体信号通路、NOD-like受体信号通路和Mincle/Dectin-1/DC-SIGN介导的NF-κB信号通路。

6部分差异蛋白转录水平的分析

选取部分与结核感染相关的差异蛋白通过qRT-PCR在mRNA水平对其进行验证，如图3.4所示：SHP-1、Coronin l、ASC、CD45、Cathepsin D、GSN、ITGB2、V-ATPase和STAT1表达上调，与iTRAQ结果一致；HSP90和Calnexin在mRNA水平并未上调，今后若开发有相应的抗体，可用Westernblot的方法再次验证；接着对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，与iTRAQ和PCR结果大致一致。

绿色方块代表高剂量组与正常对照组相比和高剂量组与低剂量组相比都差异表达的蛋白，且这些差异蛋白与结核感染相关，红色方块代表高剂量组与正常对照组相比和高剂量组与低剂量组相比都差异表达的蛋白，且这些差异蛋白与结核感染不相关；绿色字体代表高剂量组与正常对照组相比或高剂量组与低剂量组相比差异表达的蛋白，且这些差异蛋白与结核感染相关，红色字体代表高剂量组与正常对照组相比或高剂量组与低剂量组相比差异表达的蛋白，且这些差异蛋白与结核感染不相关。

M代表低剂量组，S代表高剂量组，横坐标代表蛋白名称，纵坐标代表qRT-PCR2-ΔΔCt值

动物模型的制备的设计得到研究所IACUC委员会的批准，人员都是训练有素的研究人员和实验人员，全程在ABSL-3实验室中进行，完全按照模型制备和检测的一系列SOP操作进行，遵守生物安全操作要求，无安全事故。

该模型的主要评价指标为不同感染期的肺脾肝荷菌量和病变评分值，该模型与国内外报道的经典cornell模型类似，但是cronell模型的问题在于模型潜伏期荷菌量过高，复发期3-9个月后不等。本模型不断的摸索尝试克服以上问题，模型均一，参数指标稳定，各感染期的荷菌量值水平合适（不过低也不过高），周期明显缩短，由3-9个月不等的周期缩短到比较稳定的10周，便于应用。

该模型不仅可以用于潜伏及复发的早期诊断分子的研究，还可以利用潜伏及复发期研究疾病机制，同时可以用于评价潜伏感染的预防性抗生素效果，以及治疗性疫苗的效果。