结核分枝杆菌感染恒河猴模型

结核病是由结核分支杆菌（结核菌）引起的一种慢性传染性疾病，结核感染通常会累及肺、淋巴系统及其它多组织器官。除少数发病急促外，临床上多呈慢性过程。常有低热、乏力等全身症状和咳嗽、咯血等呼吸系统表现。感染后潜伏期4～8周，其中80%发生在肺部，其他部位（颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼）也可继发感染。

排菌的肺结核患者是传染源,人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式。大多数的受感染者没有病症，称为潜伏结核感（latentTBinfection），但其中约5-10%的潜伏感染者会发展至活动性结核；若无适当治疗，一个活动病例平均每年可使10～15人新受感染，病例本人的死亡率则超过50%。若潜伏感染者同时罹患免疫抑制，如艾滋病，每年就有10%的病发机率。

肺结核病程较复杂，临床分型有：1、原发型肺结核(Ⅰ型): 肺内渗出病变、淋巴管炎和肺门淋巴结肿大的哑铃状改变的原发综合征。儿童多见，仅表现为肺门和纵隔淋巴结肿大。 2、血型播散型肺结核(Ⅱ型):包括急性血型播散型肺结核及亚急性、慢性血型播散型肺结核。 3、继发型肺结核(Ⅲ型):可以出现以增殖为主、浸润为主、干酪病变为主或以空洞为主等多种病理改变。

结核菌进入机体后，被巨噬细胞吞噬，结核菌毒力与宿主免疫力的抗衡决定着结核发病、发展和转归。结核病从感染、发病到转归均与多数细菌性疾病有显著不同，宿主反应具有特殊意义，反应分为4期：1.起始期，入侵呼吸道的结核菌被肺泡巨噬细胞吞噬。因菌量、毒力和巨噬细胞非特异性杀菌能力的不同，被吞噬结核菌的命运各异。2.T细胞反应期，由T细胞介导的细胞免疫（CMI）和迟发性过敏反应（DTH）在此期形成，从而对结核病发病、演变及转归产生决定性影响。3.共生期，大部分感染者结核菌可以持续存活，细菌与宿主处于共生状态。纤维包裹的坏死灶干酪样中央部位被认为是结核杆菌持续存在的主要场所。低氧、低PH和抑制性脂肪酸的存在使细菌不能增殖。宿主的免疫机制亦是抑制细菌增殖的重要因素，倘若免疫损害便可引起受抑制结核菌的重新活动和增殖。4.细胞外增殖和传播期，固体干酪灶中包含具有生长能力、但不繁殖的结核菌。干酪灶一旦液化便给细菌增殖提供了理想环境。即使免疫功能健全的宿主，从液化干酪灶释放的大量结核杆菌亦足以突破局部免疫防御机制，引起播散。

结核病的全身症状是全身乏力、午后低热、盗汗、食欲不振、消瘦等；呼吸道症状是咳嗽、咳痰、咯血、胸疼、呼吸困难等。其特征性病理改变是肉芽肿病变和结核性结节，其基本病理变化为渗出性病变、增生性病变和坏死性病变。渗出性病变以炎症细胞、单核细胞肌纤维蛋白为主要成分，增殖性改变以结核结节及结合性肉芽肿为主，坏死的特征性改变为干酪样改变。结核性炎症的主要特是上皮样细胞结节及郎格汉斯细胞。实验室痰培养为菌阳性，抗酸染色可见细长略弯曲的杆菌，血沉加快。肺的原发病灶、淋巴管炎和肺门淋巴结结核合称为原发综合症，X线影像学上的典型表现为哑铃状阴影。感染3-8周后结核菌素皮试转阳，95%的健康感染者原发综合征自然消退，成为潜伏感染人群，约5%在日后因潜在感染复燃而发病,结核病起病缓慢，病程较长。

3.1动物的选择

3周岁以上的健康中国产恒河猴作为实验的研究对象。由于恒河猴在自然条件下也存在一定比例的结核分支杆菌的感染，为此对进入实验的恒河猴需要进行体检。最主要的一项是进行OT测试。旧结核菌素试验采取猴外眼睑皮内注射的方式，注射0.1mL旧结核菌素。猴麻醉后，在猴的右上眼睑皮内注射旧结核菌素（ColoradoSerum Company生产的TuberculinMammalian, Human Isolates Intrademic）0.1mL，注射后24h，48h，72h观察实验猴的旧结核菌素反应。

实验前3只恒河猴未出现红肿反应，旧结核菌素反应阴性。

3.2动物的饲养和运输

经OT和X光检测结核阴性的动物可以进入ABSL-3实验室。动物麻醉后正常途径进入。进入负压猴笼饲养。常规猴粮，高压灭菌水，每日饲以半个苹果。温度和湿度以及光照条件为常规ABSL-3实验室条件。

感染后猴子的运输采用专用猴运输箱，操作参考感染猴运送SOP。

3.3结核分支杆菌的准备

结核分支杆菌的复苏 从ATCC购买的Erdman菌株（ATCC35810）或结核耐药株（内部编号94789），自-80℃冰箱取出，融化，用7H9液体培养基稀释，分装。取稀释后的Erdman菌液接种L-J培养基斜面，100μL/支，37℃培养3周，菌落长至合适大小。在斜面上加3-4mL7H9培养基，将菌落自斜面上轻轻刮下，转移至研磨器中，研磨均匀，将研磨好的菌液适当稀释，分装，去一管转接到L-J斜面生长用于菌落计数，其余菌放-80℃冰箱保存备用。

3.4恒河猴的麻醉和复苏

在进行纤支镜和X光检测时由于操作时间较长，需要使用长效麻药复方氯胺酮麻醉动物，用生理盐水1：5稀释麻药，稀释液按照每公斤体重0.1ml的标准肌肉注射麻药，麻醉动物。实验结束后肌肉注射苏醒剂苏醒3号。具体操作参考SOP。

3.5纤维支气管镜的感染操作

动物平放于手术车上，固定四肢。长时间操作需要给动物吸氧。按照纤维支气管镜仪器操作规则，在麻醉动物的齿间放入咬合器，通过咬合器从舌与上腭间插入支气管镜，注意观察监视器，找到声门裂，小心插入支气管镜，进入气管后通过纤支镜给药通道注入2ml利多卡因（注射用）。

继续向下，转入右侧肺至下叶位置。插入感染用纤支镜喷洒导管，感染剂量100CFU。使用5mL注射器推入2mL菌液，之后再推入3mL空气，排尽注射导管内的残余菌液。将纤支镜连同注射管一同取出，进行清洗。清洗程序注射管推入5mL生理盐水，再推入消毒酒精5ml，推入清水5ml，推入生理盐水5ml。取出注射管，纤支镜用生理盐水清洗。

检测感染结核分支杆菌数量，感染用菌液经L-J斜面培养计数。

3.6动物静脉取血

麻醉动物剪去肘部猴毛，暴露皮肤。酒精面擦拭皮肤表面消毒。5ml注射器静脉采血，取抗凝血和自凝血。分别分离细胞和血清，进行下列血沉、CRP、细胞因子、流式细胞学抗结核抗体等实验。血清分离后冻存于低温冰箱。

3.7动物体温测定

体温芯片的植入：准备好芯片扫描仪,检查是否有电，给体温芯片编号，将芯片录入。麻醉动物后，选择后颈部或上臂近后肩处，酒精棉消毒后，提起皮肤，在皮下植入体温芯片，检查芯片固定的位置，是否脱出，消毒进针口。用芯片扫描一下检验是否正常。

3.8动物的胸部X光检查

检查的头一天晚上实验猴禁水食，检查当天对动物进行麻醉，用数字X光机检查肺部。使用的参数如下：

选择狗的模式，设置参数 高度：64cm，厚度：12cm电压：50kv 电流：1.8~2.4mA之间, 根据猴的大小，固定电压值，调电流。

3.9 CT

检查的头一天晚上实验猴禁水食，检查当天对动物进行麻醉，用数字X光机检查肺部。

在人用的CT机器上选择幼儿参数模式，调节电压和电流使图像分辨率达到要求，如电压为120kv,电流为350mA。设置参数建立三维图, 图像存储为dicom格式，用软件计算病变的体积。

3.10 CRP检测

取全血2ml于血清管中，4℃3000rpm离心20min分离血清。血清中C-反应蛋白测定按照MONKEY C-REACTIVE PROTEIN(CRP)ELISA TEST KIT说明书进行操作，结果以ng/ml表示。具体步骤为：按要求重悬标准品后，依次稀释成75ng/ml，37.5 ng/ml，18.75ng/ml，9.38 ng/ml，4.69 ng/ml，2.34 ng/ml，1.17 ng/ml和0 ng/ml。将各浓度的标准品和1:1000稀释后的动物血清分别加至已包被抗体的96孔板中，100ul/孔。室温孵育45min，洗板后每孔加HRP标记的检测抗体100ul。室温孵育45min后，洗板，加TMB 100ul/孔进行显色。室温避光显色20min后加终止液，于450nm处读取OD值。根据标准曲线计算每只动物感染后不同时间点时血清中的C-反应蛋白含量。

3.11血沉检测

恒河猴麻醉后，取全血1.6ml于柠檬酸钠抗凝的血沉管中，颠倒混匀5—8次，垂直插在血沉架上，将血沉管血液的液面与血沉架上的0刻度线对齐，室温静置1h后观察红细胞下降的mm数。

3.12血清中结核抗体（IgG）的检测

按照结核分支杆菌抗体诊断试剂盒（胶体金法）使用说明书进行操作：将试剂和反应板取出平衡至室温，反应板上依次标号。在每个反应孔中加2滴封闭液，待吸收完全后分别加入分离的血清各40ul，之后每孔加入洗涤液各6滴，待吸收完全后每孔加2滴金标液进行显色。最后每孔加入6滴洗涤液，待吸收完全后目测结果。结果的判定以质控点和反应孔中间同时出现红色斑点为阳性，若质控点显示红色，反应孔中间无红色斑点出现或仅为痕迹者为阴性。

1恒河猴感染结核菌后OT实验

3只恒河猴感染结核分支杆菌后的第4周进行OT试验，右侧眼睑明显出现红肿，存在一定程度的闭合，个体间有一定差异。旧结核菌素反应均可判断为阳性。

2恒河猴感染结核菌前后体重的变化

3只恒河猴感染结核分支杆菌前动物的体重都呈上升趋势。在感染结核菌之后的前两周相比感染前体重也有上升。但是在感染结核菌后的4周和6周动物的体重均出现下降。在感染后的第9周B1和C6的体重基本稳定，C8的体重表现为上升。

3恒河猴感染结核菌前后体温的变化

3只恒河猴感染结核分支杆菌之后的前两周相比感染前体温相对稳定。但是在感染结核菌后的4周体温升高，感染后第6周动物的体温出现一定程度的下降，但仍高于正常体温。在感染后的第9周C6的体温仍较高。B1和C8的体温降至39度以下。B1和C8目前表现为一过性的低热，C6的体温变化仍需继续观测。

4恒河猴感染结核菌前后血沉变化

3只恒河猴感染结核分支杆菌之后的前两周相比感染前血沉相对稳定。但是在感染结核菌后的4周C6的提高，感染后第6周3只猴的血沉都有一定程度的提高。在感染后的第9周B1、C6的血沉仍较高。C8的血沉降至较低水平。

5恒河猴感染结核菌前后CRP变化

3只恒河猴感染结核分支杆菌之后的前两周相比感染前CRP相对稳定。但是在感染结核菌后的4周、6周、9周B1、C6的CRP升高。C8的CRP在感染结核后一直维持在较低水平。

6影像学检测结果

恒河猴C6 CT胸部影像和胸部X光检查结果显示其右肺中下叶存在实变影，纵隔发生右向移位，心脏偏于右侧，这可能是右侧肺中下叶不张引起。右肺上叶和左肺多处存在片状实变影，散点状结节影多见。根据CT和X光检测的结果判断有支气管结核和肺结核的可能。

恒河猴B1 CT胸部影像和胸部X光检查结果显示其右肺下叶存在片状影，纵隔发生右向移位，心脏偏于右侧，这可能是右侧肺下叶不张引起。肺组织偶见散点状结节影。

恒河猴C8 CT胸部影像和胸部X光检查结果显示其右肺中下叶后段存在渗出影，CT能动态监测右肺叶的病变, 如图8。由于C8猴的病变较轻，因此在CT引导下进行组织病理活检，确证结核感染。

7结核抗体检测

采用临床人类使用的结核抗体检测的胶体金法对感染动物的血清进行了分析。在动物感染结核菌6周和9周时结核抗体阳性。下图显示6周时血清抗体检测结果。而在感染结核菌2周和4周时结核抗体表现为弱阳性。值得注意的是恒河猴感染前血清检测时也可以看到结核抗体的弱阳性。

8病理病变

大体病理：

肺组织各叶可见结核结节及渗出性病变，以右肺中下叶病变最重；肝细胞脂肪变性，肝脏内内可见多个结核结节；脾脏内可见多个结核结节；肾被膜下多灶性炎细胞浸润，可见少数结核结节；心房多灶性炎细胞浸润（以巨噬细胞为主）；附睾内可见结核结节；睾丸灶性坏死及炎细胞浸润；胃粘膜炎细胞浸润；支气管旁淋巴结、肺门淋巴结可见巨大结核结节；大肠、小肠、脑组织、胆囊、胰腺、腹股沟淋巴结未见明显异常；

组织病理：

肺脏各叶可见多个结核结节，大部分结核结节中央可见干酪样坏死，周围类上皮细胞及中性粒细胞、淋巴细胞围绕，可见郎罕氏巨细胞。结核结节可融合，形成较大病灶。结核结节周围肺泡腔内充满浆液性渗出物。支气管腔内可见粘液脓性物质。以右肺中下叶病变最重。脾脏可见多个结核结节。部分结核结节中央可见干酪样坏死，周围类上皮细胞及中性粒细胞、淋巴细胞围绕，可见郎罕氏巨细胞。肝脏可见多个结核结节。部分结核结节中央可见干酪样坏死，周围类上皮细胞及中性粒细胞、淋巴细胞围绕，可见郎罕氏巨细胞。轻度肝细胞脂肪变性。

肾脏被膜下多灶性炎细胞浸润，肾小球及肾小管结构破坏。肾组织内可见少数结核结节。附睾可见结核结节，由类上皮细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎细胞构成。支气管旁淋巴结可见巨大结核结节，中央为大片干酪样坏死区，周围类上皮细胞及中性粒细胞、淋巴细胞围绕，可见郎罕氏巨细胞。肺门淋巴结可见巨大结核结节，中央为大片干酪样坏死区，周围类上皮细胞及中性粒细胞、淋巴细胞围绕，可见郎罕氏巨细胞。幽门淋巴结可见结核结节，中央为干酪样坏死，周围类上皮细胞及中性粒细胞、淋巴细胞围绕，可见郎罕氏巨细胞。

9 组织菌培养

猴的所有肺叶、肺门淋巴结、支气管淋巴结的结核菌的荷菌量很高，脾、肾组织中中等水平荷菌量，肝、附睾、腹股沟淋巴结的荷菌量很低。其它组织的菌培养为阴性。在观察期间肺组织的活检培养为阳性。

动物模型的制备的设计得到研究所IACUC委员会的批准，人员都是训练有素的研究人员和实验人员，全程在ABSL-3实验室中进行，完全按照模型制备和检测的一系列SOP操作进行，遵守生物安全操作要求，无安全事故。

该模型的主要评价指标为不同感染期的肺脾肝荷菌量和病变评分值，该模型与国内外报道的经典cornell模型类似，但是cronell模型的问题在于模型潜伏期荷菌量过高，复发期3-9个月后不等。本模型不断的摸索尝试克服以上问题，模型均一，参数指标稳定，各感染期的荷菌量值水平合适（不过低也不过高），周期明显缩短，由3-9个月不等的周期缩短到比较稳定的10周，便于应用。

该模型不仅可以用于潜伏及复发的早期诊断分子的研究，还可以利用潜伏及复发期研究疾病机制，同时可以用于评价潜伏感染的预防性抗生素效果，以及治疗性疫苗的效果。