结核分枝杆菌感染豚鼠模型

结核病是由结核分支杆菌（结核菌）引起的一种慢性传染性疾病，结核感染通常会累及肺、淋巴系统及其它多组织器官。除少数发病急促外，临床上多呈慢性过程。常有低热、乏力等全身症状和咳嗽、咯血等呼吸系统表现。感染后潜伏期4～8周，其中80%发生在肺部，其他部位（颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼）也可继发感染。

排菌的肺结核患者是传染源,人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式。大多数的受感染者没有病症，称为潜伏结核感（latentTBinfection），但其中约5-10%的潜伏感染者会发展至活动性结核；若无适当治疗，一个活动病例平均每年可使10～15人新受感染，病例本人的死亡率则超过50%。若潜伏感染者同时罹患免疫抑制，如艾滋病，每年就有10%的病发机率。

肺结核病程较复杂，临床分型有：1、原发型肺结核(Ⅰ型): 肺内渗出病变、淋巴管炎和肺门淋巴结肿大的哑铃状改变的原发综合征。儿童多见，仅表现为肺门和纵隔淋巴结肿大。 2、血型播散型肺结核(Ⅱ型):包括急性血型播散型肺结核及亚急性、慢性血型播散型肺结核。 3、继发型肺结核(Ⅲ型):可以出现以增殖为主、浸润为主、干酪病变为主或以空洞为主等多种病理改变。

结核菌进入机体后，被巨噬细胞吞噬，结核菌毒力与宿主免疫力的抗衡决定着结核发病、发展和转归。结核病从感染、发病到转归均与多数细菌性疾病有显著不同，宿主反应具有特殊意义，反应分为4期：1.起始期，入侵呼吸道的结核菌被肺泡巨噬细胞吞噬。因菌量、毒力和巨噬细胞非特异性杀菌能力的不同，被吞噬结核菌的命运各异。2.T细胞反应期，由T细胞介导的细胞免疫（CMI）和迟发性过敏反应（DTH）在此期形成，从而对结核病发病、演变及转归产生决定性影响。3.共生期，大部分感染者结核菌可以持续存活，细菌与宿主处于共生状态。纤维包裹的坏死灶干酪样中央部位被认为是结核杆菌持续存在的主要场所。低氧、低PH和抑制性脂肪酸的存在使细菌不能增殖。宿主的免疫机制亦是抑制细菌增殖的重要因素，倘若免疫损害便可引起受抑制结核菌的重新活动和增殖。4.细胞外增殖和传播期，固体干酪灶中包含具有生长能力、但不繁殖的结核菌。干酪灶一旦液化便给细菌增殖提供了理想环境。即使免疫功能健全的宿主，从液化干酪灶释放的大量结核杆菌亦足以突破局部免疫防御机制，引起播散。

结核病的全身症状是全身乏力、午后低热、盗汗、食欲不振、消瘦等；呼吸道症状是咳嗽、咳痰、咯血、胸疼、呼吸困难等。其特征性病理改变是肉芽肿病变和结核性结节，其基本病理变化为渗出性病变、增生性病变和坏死性病变。渗出性病变以炎症细胞、单核细胞肌纤维蛋白为主要成分，增殖性改变以结核结节及结合性肉芽肿为主，坏死的特征性改变为干酪样改变。结核性炎症的主要特是上皮样细胞结节及郎格汉斯细胞。实验室痰培养为菌阳性，抗酸染色可见细长略弯曲的杆菌，血沉加快。肺的原发病灶、淋巴管炎和肺门淋巴结结核合称为原发综合症，X线影像学上的典型表现为哑铃状阴影。感染3-8周后结核菌素皮试转阳，95%的健康感染者原发综合征自然消退，成为潜伏感染人群，约5%在日后因潜在感染复燃而发病,结核病起病缓慢，病程较长。

1实验用豚鼠的选择：

选择体重:300~350gSPF级，雌性Hartley豚鼠（提供厂商：北京维通利华实验动物技术有限公司）。动物使用申请号:中国医学科学院实验动物研究所实验动物管理委员会（批准号：MC—09-2003）。

2饲养环境

—动物生物安全3级实验室（ABSL-3）；温湿度范围：18-28℃；相对湿度：40-70％；换气次数：机械送排风；明暗周期：12h/12h；照度：150-300Lux；清洁消毒：用具、笼架等在投入使用前进行消毒；笼具种类及饲育密度：豚鼠笼，3只一笼；

3饲养条件

饲料:中国医学科学院实验动物研究所华阜康有限公司豚鼠专用饲料,自由采食；垫料为中国医学科学院实验动物研究所华阜康有限公司，定期更换；饮水；普通自来水经过高压(121℃,30min)，自由饮用。

4观察

豚鼠在进入ABSL-3实验室之后，进行检疫，PPD阴性者，观察4~5天后，进行感染实验.

5实验用豚鼠的分组及感染：

实验共分为四个大组，第一组为正常对照组(生理盐水)、第二组为高剂量组（1X10^{4 CFU）、第三组为中剂量组（1X103 CFU）和第四组低剂量组（1X102 CFU）。每组36只均，共144只（5只备用，实际为150只），均采用后肢蹊部皮下注射。}

6感染用菌株

结核分支杆菌标准菌株Dt株（ATCC35810）和结核菌耐药株（内部编号94789）

7实验观察

感染后，每天观察感染豚鼠的临床症状，每周称取豚鼠体重，观察不同感染剂量豚鼠体重和脏器指数的变化规律。

8解剖后病理和荷菌量检测

分别在感染后1d、2d、3d、5周和6周，每组解剖6只豚鼠，分别无菌活体心脏取血，并在解剖后1/2脾脏、1/2肺脏和1个腹股沟淋巴结，无菌研磨后接种L-J斜面进行结核分支杆菌的分离培养。并将同一组织的剩余部分固定在10%福尔马林中，进行病理切片。

1. 感染后动物的临床症状观察

豚鼠表现为被毛凌乱不规则，饮食欲差等，以高剂量组表现较为明显。小鼠感染结核菌后主要是在毛发凌乱不规则，活动少，精神状态、食欲差，以尾静脉感染组小鼠比较重。

2. 感染后动物体重的变化结果

2.1感染后的豚鼠脏器指数

变化主要表现在脾脏和肺脏，豚鼠在体重下降的同时脾脏在感染后一周内脏器指数没有明显的变换，但在一周之后脾脏体重指数不断升高，最高达到了0.03%。肺脏体重指数是在感染后3天就开始升高，第7天时达到一个峰值，最高达到1%，7天后缓慢下降。变化曲线见图1、2：

图1 豚鼠感染结核分支杆菌后脾脏体重指数变化曲线

图2 豚鼠感染结核分支杆菌后肺脏体重指数变化曲线

3感染后动物病理变化

3.1 豚鼠感染后解剖眼观病理变化

豚鼠在感染5周时，解剖发现在脾脏、肝脏、肺脏及大网膜上有不同程度突出于脏器表面、粟米大小、灰白色半透明的结核病灶，且脾脏肿大。结果见图3：

图3 豚鼠感染结核分支杆菌后解剖眼观病理变化

A:脾脏；B:肺脏；C:肝脏

3.2豚鼠的组织病理病变

正常对照组的肺脏和脾脏未见明显病理改变。104CFU、103CFU、102CFU组内均有不同程度 肺组织内血管旁淋巴细胞浸润，肺组织内肉芽肿，肝脏也有肉芽肿和坏死灶，病变主要集中在脾脏，脾脏肉芽肿、坏死灶和多核细胞。结果见图3：

图3 豚鼠病理切片HE染色结果

A:正常肺脏；B:正常脾脏；C:肺组织内血管旁淋巴细胞浸润C: 脾脏组织内肉芽肿；EF:肝组织内肉芽肿及坏死灶

4豚鼠组织荷菌量

感染两周后，104CFU、103CFU、102CFU组的肺、脾、淋巴结中均可培养出结核菌。其中104CFU组在感染1天后上述组织即可培养出结核菌，而103CFU、102CFU组则在感染后7天培养出结核菌。感染5周后脾组织荷菌量见下图4：

图4 豚鼠感染结核菌5周后脾组织荷菌量

横坐标所示：A：102CFU,103CFU，104CFU组；纵坐标所指：log10CFU值。

动物模型的制备的设计得到研究所IACUC委员会的批准，人员都是训练有素的研究人员和实验人员，全程在ABSL-3实验室中进行，完全按照模型制备和检测的一系列SOP操作进行，遵守生物安全操作要求，无安全事故。

该模型的主要评价指标为不同感染期的肺脾肝荷菌量和病变评分值，该模型与国内外报道的经典cornell模型类似，但是cronell模型的问题在于模型潜伏期荷菌量过高，复发期3-9个月后不等。本模型不断的摸索尝试克服以上问题，模型均一，参数指标稳定，各感染期的荷菌量值水平合适（不过低也不过高），周期明显缩短，由3-9个月不等的周期缩短到比较稳定的10周，便于应用。

该模型不仅可以用于潜伏及复发的早期诊断分子的研究，还可以利用潜伏及复发期研究疾病机制，同时可以用于评价潜伏感染的预防性抗生素效果，以及治疗性疫苗的效果。