SIVmac239直肠途径感染恒河猴模型

一、 艾滋病概述

艾滋病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiency Virus, HIV）引起，以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病，是20世纪危害人类健康和生命最严重的病毒性疾病之一。自美国CDC报道首例艾滋病后，到20世纪80年代中期艾滋病发展成为一个性的流行病。截止2014年底，HIV已感染3690万人，2014年新增感染者200万，2014年因艾滋病死亡120万人。艾滋病在1985年传入我国，截至2015年5月31日，历年累计报告艾滋病530628例，其中艾滋病病人217457例，死亡167159例。艾滋病早已成为关注的公共卫生和社会热点问题，艾滋病的预防与治疗也成为当代生物医学研究的前沿热点之一。

二、艾滋病动物模型简介

艾滋病发病机制研、药物和疫苗的保护性研究及评价等方面在很大程度上依赖理想的动物模型。人们发现HIV以后，用HIV感染过多种动物，但由于种种原因，结果并不理想。研究发现猴免疫缺陷病毒(SIV)感染实验用猴的模型效果比较理想，表现为和AIDS的临床表征，发病过程、免疫缺陷特征等非常相似，加之HIV和SIV有一定的基因同源性，人和猴的生物学特性也较其他动物接近，因而，SIV/SAIDS(猴艾滋病)模型被广泛接受和应用。

SIV是猴获得性免疫缺陷综合征（SimianImmune Deficiency Syndrome，SAIDS）的主要致病病毒，为典型的C型病毒粒子，基因组长度大约为9.2kb，基因组成同HIV-1和HIV-2基本相同，其完整的原病毒基因含有二个LTR以及同HIV类似的基因：gag、pol、vif、tat、rev、env和nef。所有基因在SIV的排列顺序同HIV完全一样。目前国内外对SIV的研究多集中在非克隆株SIVmac251和克隆株SIVmac239上，因为这两个病毒株能在多种猕猴属动物身上引发致死性免疫缺陷综合征，同时伴有CD4+淋巴细胞下降，继发机会性感染病毒性脑膜脑病。这些都与人类AIDS类似。

艾滋病的三种传播途径分别是经血液、性和母婴传播，性传播包括同性传播和异性传播两种方式。艾滋病动物模型的制备首先要考虑其实际应用价值，最好的动物模型可以最大限度的模拟人类疾病，包括使用与自然感染相同或接近的方式建立模型。为模拟同性间性传播的感染方式，通过直肠粘膜上皮途径感染，病毒直接感染M细胞、上皮细胞等。直肠的生理构造及上皮细胞厚度非常薄等特点，都使直肠感染较阴道感染容易发生。将病毒缓慢注入猴直肠内，可建立同性性传播动物模型。

1、 实验用病毒：感染毒株为SIVmac239中国恒河猴细胞适应株，使用中国恒河猴PBMCs扩增制备，CEMx174细胞滴定TCID50为3×105/mL。

2、 感染动物：选用体重4-6kg的SPF恒河猴。实验前体检无异常，必须排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相关的4种基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）筛查结果为阴性。所有感染动物必须在ABSL-3室中进行。

3、 感染方法：将麻醉好的实验猴放在操作台上，动物采取俯卧位以保证直肠粘膜充分暴露，缓慢将SIVmac239中国恒河猴细胞适应株的稀释液注入肛窦处，实验猴保持此姿势30min。

4、 SIVmac239直肠感染猴样品采集和指标测定：用DMEM培养基稀释成100TCID50/3mL和1000TCID50/3mL两种浓度，采用小剂量多次直肠暴露的方式感染，3mL/只。共接种10次，2次/周。在每次感染前及10次感染结束后定期采EDTA抗凝血3ml，分别测定血常规、血浆病毒载量、CD4+/CD8+、CD4+和CD8+细胞绝对数。

5、 SIVmac239直肠感染猴血浆病毒载量的测定：提取EDTA抗凝血浆中病毒RNA，使用SYBR Green I 实时荧光定量RT-PCR方法测定血浆病毒载量。

6、 SIVmac239直肠感染猴外周血CD4+/CD8+比值及绝对数测定：CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE抗体标记EDTA抗凝全血淋巴细胞，流式细胞仪测定CD4+/CD8+比值，并根据血常规结果，计算出CD4+和CD8+细胞绝对数。

1、 SIVmac239直肠感染恒河猴血浆病毒载量结果

SIVmac239感染10次之后，恒河猴G0101R-G0108R均已被感染，血浆病毒RNA载量和载量峰值的时间点各不相同。其中，G0103R，G0107R和G0108R这三只猴在感染后病毒载量直接到达高峰，并出现典型的疾病进程，其中G0103R第14天时达到高峰，峰值约106copies/mL，G0107R和G0108R在感染后第28天达到峰值，这三只猴的病毒载量出现相对较早；G0102R，G0104R和G0105R在感染后2-3周病毒载量呈现低拷贝复制状态，波动在102-103 copies/mL之间，而到40天时，病毒载量才达到高峰，上升到106copies/mL；而G0101R和G0106R的病毒载量一直处于临界值，时有时无，从未达到病毒载量的高峰。根据病毒载量的情况及变化规律（图1）。8只恒河猴可分成三组类型：G0101R和G0106R划分为第一组（典型疾病进展型），将G0102R，G0104R和G0105R划分为第二组（延迟进展型），将G0103R，G0107R和G0108R划分为第三组（隐匿型）。

图1 SIVmac239小剂量多次直肠途径感染中国恒河猴血浆病毒载量结果

Fig.1 The viremia (viral RNA copies/mlplasma) in Chinese-original rhesus macaques infected intrarectally withrepeated low dose of SIVmac239

SIVmac239直肠感染恒河猴外周血CD4+/CD8+比值结果

外周血中CD4+/CD8+的比例变化除G0103R在第88天时出现明显倒置外，其余恒河猴外周血中CD4+/CD8+的比例在整个感染过程中均未出现倒置现象。G0101R和G0106R猴CD4+/CD8+的比例变化在感染后46天时呈现逐渐增加的趋势，但到感染后第88天时，其比例又恢复到接近感染前的水平，波动在1.4-2.4之间。G0102R，G0104R和G0105R猴CD4+/CD8+的比例在感染后第7天时有所增加，随后一直平稳维持在1.5-2.5之间，到第88天时，其比例有所下降，并出现CD4+/CD8+比例倒置现象，其比例约为0.9左右。G0103R，G0107R和G0108R猴以G0103R变化最明显，其比例呈现逐渐下降的趋势，到第88天时，CD4+/CD8+比例下降到0.39，其余两只猴未出现CD4+/CD8+比例倒置现象，波动在1.1-1.3之间（图2）。

图2 SIVmac239小剂量多次直肠途径感染中国恒河猴外周血CD4+/CD8+比值

Fig.2 The changes of CD4+/CD8+ ratio of T lymphocytes in Chinese-original rhesus macaques infectedintrarectally with repeated low dose of SIVmac239

1、 SIVmac239直肠感染恒河猴CD4+和CD8+细胞绝对数结果

感染猴外周血中CD4+T淋巴细胞绝对数在SIVmac239感染前后变化幅度不大，只是变化趋势有所不同，G0101R和G0106R猴CD4+T淋巴细胞绝对数在感染第88天时略高于感染前的水平，其中以G0101R增加最显著，由感染前的1.5×103个/uL增加到感染后第88天时的2.1×103个/uL。G0103R，G0107R和G0108R猴感染前的CD4+T淋巴细胞绝对数低于其他5只，波动在600-800个/uL之间，到感染后第14天时，有所下降，随后有所恢复，到第88天时，CD4+T淋巴细胞绝对数略低于感染前的水平。G0102R，G0104R和G0105R猴的CD4+T淋巴细胞绝对数也同样在感染后第14天出现下降，21天时又有所增高，但与感染前相比，到感染后第88天时，这三只猴的CD4+T淋巴细胞绝对数均略低于感染前的水平（图3A）。

SIVmac239感染后，G0101R和G0106R猴CD8+T淋巴细胞绝对数的波动较为平稳，未出现显著的降低或者升高的现象。G0103R，G0107R和G0108R猴CD8+T淋巴细胞绝对数的变化也相对稳定，在感染前其绝对数的水平也相对较低，但是G0103R的绝对数在第14天下降之后明显增高，可达474个/uL，随后一直维持在此水平上波动。G0102R，G0104R和G0105R猴的CD8+T淋巴细胞绝对数在感染后第14天时下降最为显著，最低可达340个/uL，随后有所恢复，到第88天时，其绝对数变化接近感染前的水平（图3B）。

图3SIVmac239小剂量多次直肠途径感染恒河猴外周血CD4+和CD8+细胞绝对数变化

Fig.3 The CD4+ cell counts and CD8+ cell counts (per l blood) inChinese-original rhesus macaques infecte intrarectally with repeated low doseof SIVmac239

所有感染动物必须在ABSL-3室中进行。

1.该模型制备比较成熟，国内外都有此模型，构建和评价指标一致，所以该模型应用广泛，具有统一的操作规程。

2. 该模型制备的关键：1）小鼠必须是重度免疫缺陷的，而且饲养环境必须洁净；2）HIV操作需要生物安全。

3.此模型具有完善的人的免疫系统，HIV感染后，具有艾滋病病人相似的临床症状，所以具有很高的比较医学应用价值。