慢性束缚应激体力疲劳小鼠模型

1. 目的

通过慢性束缚应激的方法，构建能够很好模拟当今社会人们所处的工作环境和生活状态而引起的“亚健康”体力疲劳：如长期伏案或在有限空间内工作、缺少运动、以及工作和生活所带来的生理和心理压力等等，以用于抗体力疲劳药品和保健品的功效评价。

2. 意义

随着社会的进步和高速发展，人们的生活节奏日益加快，所面临的社会竞争也随之加大，长期处在生活和工作压力下，身体容易出现精力不够、注意力不集中、疲惫乏力甚至酸痛等的疲劳状况。当今，疲劳已成为广泛存在且不容忽视的健康问题。随着生活水平的提高，人们对保健品的需求也在不断增大，通过服用具有缓解体力疲劳的保健品可以降低或消除机体的疲劳现象，使其体力恢复到正常。因此, 建立稳定的体力疲劳动物模型和功效评价方法就显得尤为重要。目前常用的方法是采用正常动物通过强迫运动而造成其急性体力疲劳，而非真正的疲劳动物模型。随着社会的进步，人们的生活习惯和工作性质发生了很大改变，高自动化的机械设备替代了原来完全靠人工进行的强体力劳动，因此疲劳的表现也有了很大的不同。本研究采用慢性束缚应激(CRS)的方法，将动物限制在狭窄空间内无法自由活动而造成体力疲劳，能很好地模拟当今人们因长期应激所导致的“亚健康”状态的体力疲劳状态，如长期伏案或在有限空间内工作、缺少运动、睡眠不足、以及工作和生活所带来的生理和心理压力等。

3. 国内外研究进展

国内外文献中已报道的造成体力疲劳动物模型的方法有：强迫运动、应激、化学、免疫和炎症、放射线、手术、基因工程和癌因等单一因素或多种因素诱导的方法构建的一系列用于疲劳研究的动物模型[1]。而在这些方法中，强迫运动法是最为常用的造成体力疲劳的方法，如强迫游泳、转轮攀爬、跑步等。我国原卫生部于2003年印发的《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）中的“缓解体力疲劳”保健品功能评价方法是采用的负重游泳实验。除此之外，文献中亦有采用束缚、睡眠干扰、或多种刺激因素相结合的（电击、冰水刺激、噪声刺激、）应激方法导致的动物疲劳[1]。如：Tanaka等对SD大鼠进行睡眠干扰5天，就可导致其负重游泳力竭时间缩短等疲劳样行为[2]；Park等[3]将雄性C57BL/6J小鼠置于与其紧密接触且无法活动的圆柱形束缚器（长10 cm，直径3 cm）中，每天束缚3 h，共15天可造成小鼠在空场中自主活动降低和强迫游泳不动时间延长等疲劳症状[3]。为了模拟人们在日常环境中所受到的复杂因素影响，可同时使用上述物理方法进行多重刺激从而造成动物疲劳的模型, Zou等采用电击、冰水游泳和束缚刺激多因素刺激23天造成SD大鼠转轮运动降低、自主活动减少等疲劳现象[4]；Shao等采用束缚、强迫运动、拥挤环境饲养和嘈杂声中暴露4种方法想结合成功诱导了SD大鼠的疲劳模型[5]；Zhao等采用睡眠剥夺、强迫游泳、束缚和夹尾造成小鼠负重游泳力竭时间缩短和空场自主活动降低等疲劳症状[6]。尽管这些诱导疲劳的方法能够模拟当今人们的生活工作状态，但因为没有动态观察和比较动物出现疲劳现象的最佳时机，造模参数各异。

我们采用ICR、C57BL/6N或BALB/C雄性小鼠，每天对其束缚8小时、连续束缚15天可稳定造成其体力疲劳，表现在强迫游泳首次连续下沉时刻明显提前、力竭时间显著缩短、自主活动和抓力明显降低；肝糖原和血尿素氮水平降低、血乳酸和肌糖原水平升高。并揭示该疲劳的发生与肠道微生物失衡和犬尿氨酸代谢紊乱、腓肠肌肌肉功能障碍有关。腓肠肌肌肉功能障碍可能涉及由AMPK信号通路介导的肌肉线粒体功能损伤以及自噬受阻的能量代谢失衡而产生。

参考文献：

1)王智，闫明珠，夏天吉，刘新民，潘瑞乐，周云丰，陶雪，常琪*. 疲劳的动物模型及发生机制研究进展. 世界科学技术-中医药现代化，2021 23(6):1937-1943.

2)Tanaka M, Nakamura F, Mizokawa S, Matsumura A, Nozaki S, Watanabe Y. Establishment and assessment of a rat model of fatigue [J]. Neuroscience Letters, 2003, 352(3):159-162.

3)Park, S. H.; Jang, S.; Lee, S. W.; Park, S. D.; Sung, Y. Y.; Kim, H. K., Akebia quinata Decaisne aqueous extract acts as a novel anti-fatigue agent in mice exposed to chronic restraint stress. J Ethnopharmacol 2018, 222, 270-279.

4)Zou J, Yuan J, Lv S, et al. Effects of exercise on behavior and peripheral blood lymphocyte apoptosis in a rat model of chronic fatigue syndrome [J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2010, 30(2): 258-264.

5)Shao C, Ren Y, Wang Z, et al. Detection of Urine Metabolites in a Rat Model of Chronic Fatigue Syndrome before and after Exercise [J]. Biomed Res Int, 2017, 2017: 8182020.

6)Zhao R, Hao W, Ma B, et al. Improvement effect of Lycium barbarum polysaccharide on sub-health mice [J]. Iran J Basic Med Sci, 2015, 18(12): 1245-1252.

1 实验材料 1.1实验动物

ICR雄鼠12x4=48只（购自北京市维通利华实验动物技术有限公司），4周龄，体重21-23g，许可证号：SCXK（京）2017-0020。动物购入后于SPF级动物房中饲养。自由进食给水，保持实验室安静，实验室温度22-25oC，湿度50-60%，明暗周期12h/12h。

1.2实验材料

乳酸（LD）试剂盒（南京建成：20191102）；肌／肝糖原试剂盒（南京建成：20191102）；乳酸脱氢酶测定试剂盒（中生北控：190771）；葡萄糖测定试剂盒（中生北控：190871）；肌酐测定试剂盒（中生北控：190721）；尿素测定试剂盒（中生北控：190971）；天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒（中生北控：190841）；丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒（中生北控：190821）。

小鼠束缚器（直径3cm，长度7.5cm）；小鼠负重游泳测试分析系统（中国医学科学院药用植物研究所）；大小鼠抓力仪（YLS-13A，济南益延科技发展有限公司）；小鼠自主活动计算机在线检测系统（中国医学科学院药用植物研究所）；酶标仪；全自动生化仪（Beckman AV480）。

2 实验方法 2.1分组及实验

适应性饲养4d，根据体重将动物随机分为以下4组（n=12）。①组为空白组，④组于第1d开始进行束缚，③组于第6d开始进行束缚，②组于第11d开始进行束缚。于第16d各组分别完成0、5、10、15d的慢性束缚应激，各组动物于同一天进行行为学检测。

CRS组每天束缚8小时（12:00-20:00）。实验期间记录小鼠体重，在第16d进行空场检测及负重强迫游泳，次日进行抓力测试和取材。

2.2行为学检测 2.2.1抓力测试（Gripstrength）

第16天测试小鼠前肢肌肉力量。将小鼠置于大小鼠握力仪上，小鼠前肢握住握力仪，轻轻牵拉小鼠尾部，将会产生反作用力。逐渐增大拉力直到动物松爪，握力仪高精度力量传感器将会记录下最大拉力，每只小鼠测量3次取平均值。

2.2.2空场实验（Open-field）

将小鼠放入自主活动测试仪（长宽各30 cm，高60 cm）中适应环境3min，然后开始记录其在5min内的活动总路程、运动路程、运动时间、平均速率、中央区运动路程比率等指标。

2.2.3负重游泳实验（Exhaustive swimming test）

小鼠负重游泳测试分析系统通常用来测试小鼠疲劳情况，通过负重后在水中的游泳行为来考察其体力情况。仪器包括电脑、水箱、摄像头三个部分，负重游泳测试系统共四个泳道，可供4只小鼠同时进行实验。

第16天将小鼠置于独立自动检测的游泳箱中游泳，水温(25±0.5)°C，水深≥25cm。将小鼠尾部附上8%重量后，通过前端和上方两个摄像头实时记录小鼠自游泳开始至力竭时间段内的行为。小鼠头部沉入水中后7s仍不能返回水面时，判断为力竭，测试终止。记录首次下沉时间、首次连续下沉时刻、下沉次数、水上以及水下运动时间和不动时间以及力竭时间等。游泳结束后，立即捞出小鼠，擦干小鼠身上的水分，放回原来的笼中。

2.3 取材及生化检测

准确计时游泳30min后，休息30min，然后在戊巴比妥钠麻醉下取血、肝脏、肌肉（腓肠肌）组织用于后期生化指标测量。取得血静置4h后，3500r/ min，15min离心得血清。

使用南京建成乳酸试剂盒，肌／肝糖原试剂盒按照试剂盒内说明书方法操作对血清乳酸以及肝脏进行检测，得到所有小鼠的血乳酸、肌糖原和肝糖原含量。使用中生北控乳酸脱氢酶测定试剂盒；葡萄糖测定试剂盒；肌酐测定试剂盒；尿素测定试剂盒；天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒；丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒，通过全自动生化仪检测小鼠血清肌酐（Cre）、尿素（Urea）、血糖（Glu）、乳酸脱氢酶（LDH）和谷丙转氨酶(AST)水平。

2.4 数据分析

实验结果以均数±标准误（Mean ± SEM）表示，采用SPSS 25.0进行统计分析，P < 0.05为产生统计学差异。

3实验结果3.1 不同CRS周期对ICR小鼠体重的影响

如图1所示，与空白组相比在接受后，CRS小鼠在应激下体重将发生一定程度的降低。经过几天的束缚，小鼠适应应激后体重开始稳定增长，但仍然显著低于空白组。最后不同束缚天数的小鼠体重趋于相近，但CRS 15d小鼠仍低于其余小鼠。

图1 不同周期下CRS对ICR小鼠体重的影响。（n＝12，Mean ± SEM）。

3.2 不同CRS天数对ICR小鼠负重强迫游泳的影响

由图2可见，在负重强迫游泳过程中，与空白组相比不同周期CRS下ICR小鼠均表现出一定程度的疲劳状态，其力竭游泳时间均缩短。CRS5d小鼠力竭时间具有缩短趋势，CRS10d和15d小鼠力竭时间显著缩短（P<0.01，P<0.01）。与CRS10d相比CRS 15d小鼠疲劳程度进一步加深。

图2不同周期下CRS对ICR小鼠负重游泳力竭时间的影响。（n＝12，Mean ± SEM），**P＜0.01。

因首次下沉时刻出现过早，且小鼠间游泳习惯可能存在较大差异，在作为评价指标时易出现误判。故我们提出首次连续下沉时刻这一指标，首次连续下沉时刻为动物从负重游泳开始直到连续在短时间内下沉2次及以上的时刻。如图3所示，CRS会引起小鼠负重游泳时的首次连续下沉时刻提前，5、10和15dCRS应激均能显著降低ICR小鼠的首次连续下沉时刻（P<0.01，P<0.01，P<0.001）。CRS5d小鼠的负重游泳首次连续下沉时刻已显著提前，且该指标比力竭时间可能更为敏感。

图3不同周期下CRS对ICR小鼠负重游泳首次连续下沉时刻的影响。（n＝12，Mean ± SEM），**P＜0.01; ***P＜0.001。

3.3 不同CRS天数对ICR小鼠空场自主活动的影响

临床的观察中发现，身体疲劳可能会降低人们在安静状态下主动运动的意愿，我们在空场自主活动中也观察到了CRS小鼠疲劳发生的这一变化，并于15d时变化显著。如图4所示，CRS会引起小鼠在空场中的自主活动路程和时间降低，在15d时其运动路程显著降低（P<0.05），且通过中央区运动比率可以看出该变化与焦虑等情绪无关；CRS 10d和15d小鼠的空场运动时间显著降低(P<0.05，0.05)。

图4不同周期下CRS对ICR小鼠空场中运动路程与时间的影响。（n＝12，Mean ± SEM），*P＜0.05。

3.4 不同CRS天数对ICR小鼠抓力的影响

由图5可见，束缚引起的疲劳同样能引起小鼠肌肉握力的降低。CRS 5d、10d和15d后小鼠握力均有降低，在5d和15dCRS组中握力显著下降（P<0.05，P<0.001）。

图5不同周期下CRS对ICR小鼠抓力的影响。（n＝12，Mean ± SEM），*P＜0.05; ***P＜0.001。

3.5 不同CRS天数对ICR小鼠疲劳相关生化指标的影响

如图所示，通过对小鼠束缚引起疲劳模型后对其血清和肝脏进行疲劳相关生化指标检测，得到其肌糖原、肝糖原含量以及血清中血糖（Glu）、乳酸（LA）、肌酐（Cre）、尿素（Urea）、乳酸脱氢酶（LDH）和谷丙转氨酶(AST)水平。

在剧烈运动后会产生大量代谢产物，引起LA、Cre和Urea等大量堆积从而产生疲劳。如图6所示，检测发现三组不同天数CRS小鼠游泳后的LA堆积均高于空白组，CRS10d和15d小鼠LA水平显著高于空白组（P<0.001，P<0.001）。在运动中肌酸在肌肉内供能，Cre为肌酸的终末代谢产物，疲劳小鼠中Cre将会升高。CRS后小鼠血清Cre含量均能被升高，在CRS10d和15d后，其Cre水平显著升高（P<0.001，P<0.01）。尿素是蛋白质分解代谢的产物，剧烈运动时供能不足，进一步蛋白质也会被分解供能，小鼠尿素升高。CRS组相比于空白组BUN水平均具有升高趋势，其中CRS15d小鼠Urea显著升高（P<0.05）。

图6 不同周期下CRS对ICR小鼠血清乳酸、肌酐以及尿素的影响。（n＝12，Mean ± SEM），*P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001。

糖是运动的主要能量来源，机体通过糖的有氧氧化和无氧氧化产生能量生成ATP，机体疲劳往往伴随着糖类能源物质耗竭产生。如图7所示，CRS小鼠的能源物质水平进一步下降，游泳运动后相比于空白组，CRS5d、10d和15d小鼠Glu水平均显著降低（P<0.001，P<0.001，P<0.001）。CRS5d、10d和15d小鼠肝糖原水平也均显著降低（P<0.001，P<0.05，P<0.05）。其肌糖原水平均显著升高（P<0.01，P<0.01，P<0.05），该变化可能因其运动中肌肉利用肌糖原进行糖酵解，产生更多乳酸堆积进而抑制其肌糖原的利用。

图7 不同周期下CRS对ICR小鼠血糖及肝糖原的影响。（n＝12，Mean ± SEM）， * P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001。

剧烈运动后产生大量自由基，通过氧化应激损伤机体，且AST在心肌细胞中含量较多。由图8可知，氧化应激引起心肌细胞损伤，CRS小鼠运动后与空白组小鼠相比，血清AST增高，在CRS10d和15d小鼠中其水平显著升高（P<0.05，P<0.01）。在剧烈运动后肌肉细胞因氧化应激被破坏，LDH会渗入血中，CRS10d和15d小鼠LDH含量与空白组相比均显著升高（P<0.05，P<0.05）。

图8 不同周期下CRS对ICR小鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶和乳酸脱氢酶的影响。（n＝12，Mean ± SEM），*P＜0.05; ** P＜0.01。

3.6 CRS致小鼠腓肠肌肌肉萎缩

为了研究CRS诱导小鼠疲劳发生的机制，我们对与运动耐力直接相关的骨骼肌进行了研究。如图9所示，与对照组相比，CRS处理15天后小鼠的腓肠肌重量显著下降。通过H&E染色观察腓肠肌，对照组小鼠腓肠肌肌纤维组织清晰、排列整齐，而CRS小鼠腓肠肌肌纤维形状不规则、严重分裂形成多角型萎缩。定量分析显示，CRS小鼠肌纤维的直径和横截面积显著减少。数据表明，CRS可造成小鼠肌肉质量降低并使肌纤维结构受损。

图9 CRS致小鼠腓肠肌萎缩（Mean ± SEM）。（a）小鼠腓肠肌组织解剖图；（b）腓肠肌质量；（c）代表性的腓肠肌H&E染色图，比例尺：上图500 μm，下图100 μm；（d）和（e）腓肠肌纤维直径和横截面积（n＝3）。***P＜0.001。

3.7 CRS小鼠腓肠肌转录组学研究

为了系统地研究CRS对小鼠肌肉疲劳产生的影响，通过转录组测序分析了对照组和CRS处理15天小鼠的腓肠肌。在对照组与CRS组中共发现了239个差异表达基因（DEGs）。其中CRS显著上调了195个基因，显著下调了44个基因(图10a)。KEGG富集分析结果表明6-磷酸葡萄糖流向PPP，导致脂肪酸代谢代偿性上调，以提供能量。与碳代谢相关的途径，如戊糖磷酸途径(PPP)、柠檬酸循环(TCA循环)和丙酮酸代谢等被富集(图10c)。并且结果显示，与能量代谢密切相关的AMPK信号通路受到显著调控。基于KEGG结果的热图显示，与AMPK信号通路、脂肪酸代谢和碳代谢相关的基因均受到CRS处理的显著调控(图10b)。GO分子功能分析表明，氧化还原酶等分子活性被富集；细胞成分分析显示，这些DEGs大量编码线粒体蛋白；并且在生物过程中也富集了许多脂质代谢过程相关的代谢途径(图10d)。转录组分析结果表明，CRS致小鼠疲劳的原因与碳代谢、脂代谢途径紊乱有关，并与主要供能细胞器线粒体及调控能量代谢的AMPK信号通路密切相关。

图10 通过RNA-Seq分析CRS对小鼠腓肠肌基因表达的影响（mean ± SEM，n=3）。（a）腓肠肌中239个特异性DEGs的火山图；（b）DEGs的KEGG富集分析；（c）AMPK信号通路、脂肪酸代谢和碳代谢相关的DEGs表达热图; （d）DEGs的GO富集分析。

3.8CRS诱导腓肠肌线粒体缺失和功能障碍与AMPK信号通路相关

线粒体在调节肌细胞能量供应方面发挥着重要作用。转录组测序分析的结果推测线粒体参与了CRS所导致的肌肉功能障碍。为了进一步验证该结果，我们通过透射电镜观察腓肠肌的超微结构。观察发现对照组小鼠腓肠肌线粒体形态标准，分布均匀；而CRS小鼠腓肠肌线粒体片段化、分布不均，线粒体总数减少。

线粒体标志蛋白CYT-C和TOMM20的表达降低表明CRS显著减少了线粒体的数量(图11b)。此外，对氧化磷酸化蛋白（OXPHOS）进行检测，发现UQCRC2水平的显著下降表明氧化磷酸化呼吸链受到抑制。通过免疫组化染色观察小鼠腓肠肌发现CRS小鼠MHY7表达显著降低，同样CRS处理使腓肠肌MYH7蛋白表达显著降低，揭示了CRS减少了富含线粒体的I型骨骼肌纤维。

图11CRS对小鼠腓肠肌线粒体功能障碍的影响（mean ± SEM，n=3）。（a）腓肠肌的透射电镜图；（b）腓肠肌中CTT-C、TOMM20、OXPHOS免疫印迹分析；（c）免疫印迹分析腓肠肌MYH7；（d）腓肠肌MYH7免疫组化染色，比例尺100 μm；（e-h）MYH7/GAPDH、CTT-C/GAPDH、TOMM20/GAPDH和UQCRC2/GAPDH的定量分析。*P＜0.05。

AMPK可以通过调节线粒体生物发生、融合/分裂和供能参与线粒体质量控制。为了阐明CRS诱导的肌肉和线粒体功能障碍是否与AMPK有关，我们测定了相关蛋白的表达。如图所示，与正常组相比，CRS引起小鼠腓肠肌p-AMPK/AMPK的水平显著降低。并对其下游的主要蛋白进行免疫印迹分析，发现PGC-1α及其下游因子TFAM的表达也显著降低。因此，CRS诱导的腓肠肌线粒体功能障碍与AMPK/PGC-1α信号通路受阻相关。

图12CRS对小鼠腓肠肌AMPK信号通路的影响（mean ± SEM，n=3）。（a）腓肠肌中p-AMPK、AMPK、PGC-1α和TFAM的免疫印迹分析；（b-d）p-AMPK/AMPK、PGC-1α/GAPDH和TFAM/GAPDH的定量分析。*P＜0.05，**P＜0.01。

3.9CRS对腓肠肌线粒体自噬的影响

线粒体自噬是清除受损线粒体的一种重要的线粒体质量控制机制。与对照组相比，CRS处理后PINK1和LC3表达降低，p62表达升高，表明腓肠肌线粒体自噬受阻，线粒体受损并聚积。

进一步对AMPK/mTOR信号通路进行研究，探究其线粒体自噬受阻的原因。在CRS诱导的小鼠中，p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR表达显著升高，p-ULK1 (Ser757)表达上调，导致ULK1与AMPK间的相互作用被破坏。综上所述，CRS致小鼠腓肠肌AMPK激活受阻，从而使mTOR途径异常激活抑制保护性线粒体自噬的发生。

图13 CRS对腓肠肌线粒体自噬的影响（mean ± SEM，n=3）。（a）腓肠肌中PINK1、LC3和p62的免疫印迹分析；（b）p-AKT/AKT (f)、p-mTOR/mTOR (g)和p-ULK1 (Ser757) 的免疫印迹分析；（c-h）PINK1/GAPDH、LC3-Ⅱ/GAPDH、p62/GAPDH、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和p-ULK1 (Ser757)/GAPDH的定量分析。*P＜0.05，**P＜0.01。

3.10莲须提取物对CRS小鼠负重游泳的影响

结果如图所示，与空白对照组相比，模型组小鼠在CRS处理15天后负重游泳首次连续下沉时刻显著延后。红景天和莲须给药各组较模型组首次连续下沉时刻延长，且莲须给药组的低和高剂量组与模型组相比有显著性差异。在游泳耐力上，较空白对照组相比，模型组力竭时间显著缩短。红景天何莲须给药各组较模型组力竭时间延长，且莲须给药组的高剂量组与模型组相比显著提高。

图14 莲须提取物对CRS小鼠负重游泳首次连续下沉时刻和力竭时间的影响。（n＝10-12，Mean ± SEM），与正常组相比，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型组相比，p<0.05，#p<0.001。LSL：thelowdoseofLotus Stamen，莲须低剂量组（0.5 g/kg），LSH：thehighdoseofLotus Stamen，莲须高剂量组（1g/kg），Rho：Rhodiola，红景天组。

3.11莲须提取物对CRS小鼠抓力的影响

结果如图所示，在造模15天后，与空白对照组相比，模型组小鼠在CRS刺激15天后抓力显著降低。莲须和红景天给药各组较模型组抓力均显著升高。

图15 莲须提取物对CRS小鼠抓力的影响。（n＝12，Mean ± SEM），与正常组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#p<0.05。LSL：thelowdoseofLotus Stamen，莲须低剂量组（0.5 g/kg），LSH：thehighdoseofLotus Stamen，莲须高剂量组（1g/kg），Rho：Rhodiola，红景天组。

3.12莲须提取物对CRS小鼠疲劳相关生化指标的影响

结果如图所示，在造模15天后，与空白对照组相比，模型组小鼠在CRS刺激15天后血清Glu显著降低，LDH、LA和CORT显著升高。莲须和红景天给药各组较模型组抓力均能显著恢复。

图16 莲须提取物对CRS小鼠疲劳相关生化指标的影响。（Mean ± SEM），与正常组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#p<0.05。LSL：thelowdoseofLotus Stamen，莲须低剂量组（0.5 g/kg），LSH：thehighdoseofLotus Stamen，莲须高剂量组（1g/kg），Rho：Rhodiola，红景天组。

动物饲养于中国医学科学院药用植物研究所的屏障环境，12 h 照明/12 h 黑暗( 照明: 8: 00-20:00) ，饲养期间给予动物标准饲料和洁净饮水。本动物实验遵守国际实验动物伦理学要求。

较之前的抗疲劳保健品评价方法中直接选用正常小鼠进行给药检测，该实验增加束缚应激进行造模，模拟当今社会由于长时间伏案工作、缺乏运动等情况所致的疲劳。ICR小鼠每天接受8h束缚，分别束缚5d、10d和15d，随后进行与疲劳相关的行为学检测。在负重游泳检测中除采用原唯一评价指标“力竭时间”，增设 “首次连续下沉时刻”作为早期出现指标，印证负重游泳情况，相较更加敏感且动物友好。根据临床中疲劳人群主动运动的意愿降低的现象，增加空场实验，检测CRS疲劳小鼠的自主活动距离和时间。通过抓力测试评价其肌肉力量，反应疲劳发生情况。

在CRS5d小鼠行为学检测表现出一定体力疲劳趋势，CRS10d小鼠负重游泳中力竭时间显著缩短、首次连续下沉时刻提前并且抓力降低，均表现出疲劳现象，这可以反应每天8h，持续10dCRS即可导致体力疲劳。相比CRS 10d小鼠，CRS 15d在负重游泳、空场和抓力检测中疲劳更为稳定。通过生化指标的检测，从代谢产物堆积、能量物质耗竭和氧化应激三个方面对CRS造模后小鼠疲劳状态进行分析，其在15d时疲劳生化指标更为稳定。故得出束缚造成小鼠体力疲劳模型需要连续15d，每天束缚8h造模效果更为稳定。

本研究用所建立的疲劳模型构建方法（每天8h，连续束缚15d）在C57BL/6N和BALB/C两种常用小鼠上进行了验证，探究其疲劳建模方法的种属适用性。实验发现C57BL/6N和BALB/C小鼠均表现出负重游泳力竭时间缩短和抓力降低等行为表现，表明连续15天，每天束缚8小时可以造成普遍的小鼠疲劳模型。

1.评价指标体系

1）负重游泳实验：以“力竭时间”和“首次连续下沉时间”作为动物体力的评价指标。时间越短表明动物的体力越差，反之亦然。

2）抓力实验：以“前肢抓力”作为动物肌肉力量的评价指标，抓力越大体力越强。

3）自主活动：以“运动距离”、“运动总路程”、“运动时间”作为动物体力评价指标，数值越大表明体力越好。

4）生化指标：

(1) 肝糖原：以“肝糖原”含量越高，表明其储备能源越多，在运动中体力越好。

(2) 血乳酸：以运动后血清中“乳酸”含量越低，表示其代谢产物的堆积越少，越不易疲劳。

(3) 血糖：以运动后血清中“血糖含量越高，表明其可利用能源物质剩余越多，体力越好。

(4) 乳酸脱氢酶：以运动后血清中“乳酸脱氢酶”活力越强，表明其细胞受到氧化应激损伤越严重。

2. 国内外现有模型的异同

截止目前为止，国内外文献中已报道的造成体力疲劳动物模型的方法有：强迫运动、应激、化学、免疫和炎症、放射线、手术、基因工程和癌因等单一因素或多种因素诱导的方法构建的一系列用于疲劳研究的动物模型。而在这些方法中，强迫运动法是最为常用的造成体力疲劳的方法，如强迫游泳、转轮攀爬、跑步等。除此之外，文献中亦有采用束缚、睡眠干扰、或多种刺激因素相结合的（电击、冰水刺激、噪声刺激）应激方法导致的动物疲劳。如：Tanaka等对SD大鼠进行睡眠干扰5天，就可导致其负重游泳力竭时间缩短等疲劳样行为；Park等[9]将雄性C57BL/6J小鼠置于与其紧密接触且无法活动的圆柱形束缚器（长10 cm，直径3 cm）中，每天束缚3 h，共15天可造成小鼠在空场中自主活动降低和强迫游泳不动时间延长等疲劳症状。Zou等采用电击、冰水游泳和束缚刺激多因素刺激23天造成SD大鼠转轮运动降低、自主活动减少等疲劳现象[9]；Shao等采用束缚、强迫运动、拥挤环境饲养和嘈杂声中暴露4种方法想结合成功诱导了SD大鼠的疲劳模型；Zhao等采用睡眠剥夺、强迫游泳、束缚和夹尾造成小鼠负重游泳力竭时间缩短和空场自主活动降低等疲劳症状。尽管这些诱导疲劳的方法能够模拟当今人们因繁重工作和生活压力导致的体力疲劳，但因考虑因素多、操作复杂，不易控制，并且对造模过程没有进行动态观察和比较，不能判断动物出现疲劳现象的最佳时机。此外，对慢性束缚应激所致的分子机制研究亦很有限。

3. 技术难点

（1）束缚器的选择。本实验室采用自制束缚器，束缚器长度为6-8.5 cm（可根据动物体积调节），内径为3 cm，周身有多个直径为0.5 cm 的通气孔。既保证了动物的自主呼吸，又能保证动物不会挣脱束缚器。为造模成功提供了基础。

（2）造模时长的选择。综合了前期文献调研和本实验室的实验基础，采用了每天束缚8h（10: 00～18: 00），分别束缚5d、10d和15d进行比较。

（3）动物的选择。本实验采用了常用的ICR小鼠进行实验，为了验证不同品系小鼠对实验结果的影响，因此本实验又选择了C57BL/6N和BALB/C两种小鼠进行了比较。

4. 创新性

（1）比较了每天束缚8h（10: 00-18: 00），分别束缚5d、10d和15d考察对ICR小鼠疲劳的影响。确立了采用连续15d、每天束缚8h 可以建立更稳定、更有效的动物疲劳模型。并且验证了该条件同样也适用于C57BL/6N和BALB/C小鼠。

（2）揭示了该疲劳的发生与腓肠肌肌肉功能障碍有关。腓肠肌肌肉功能障碍可能涉及由AMPK信号通路介导的肌肉线粒体功能损伤以及自噬受阻的能量代谢失衡而产生。

5. 应用价值

采用慢性束缚应激的方法，将动物限制在狭窄空间内无法自由活动而造成体力疲劳，能很好地模拟当今人们因长期应激所导致的“亚健康”状态的体力疲劳状态，如长期伏案或在有限空间内工作、缺少运动、睡眠不足、以及工作和生活所带来的生理和心理压力等。因此，该模型为缓解体力疲劳保健的功效评价提供了一个已操作、稳定可控的动物模型。