骨髓增生异常综合征/急性髓系白血病点突变斑马鱼模型

骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes, MDS)是起源于造血干细胞的一组异质性髓系克隆性疾病，特点是髓系细胞分化及发育异常，表现为无效造血、难治性血细胞减少、造血功能衰竭，高危患者会转为急性髓系白血病(AML)，往往也会容易发展为难治性AML。与原发性急性髓细胞性白血病不同，MDS/AML患者对化疗药物非常容易产生耐药性，并且是多药耐药，故本病对常规化疗不敏感，不容易取得完全缓解，需加大化疗剂量，从而造成了治疗难度。传统的治疗方法（化疗和骨髓移植）对于MDS/AML患者效果不佳，使得在传统治疗外又增加了分子靶向治疗。但目前MDS初始突变和积累突变的内在联系尚不清楚，MDS患者的病程进展机制仍然未知，这也就限制了针对MDS/AML的靶向药物研究，使已有的MDS/AML机制研究及药物治疗模式尚存不足。斑马鱼由于其独特的优势，例如与人造血发育过程类似，特别是可以进行大规模的正向基因饱和突变与筛选，在脊椎动物造血发育机制的研究中起着重要的作用。因此，获得MDS/AML斑马鱼白血病模型具备独特的优势：（1）阐明 MDS/AML过程中关键基因的改变，阐明这些基因之间的关系。（2）建立类似于人类白血病的斑马鱼疾病模型。藉此建立一个MDS/AML的白血病高通量靶向药物筛选平台。

首先通过ENU诱变斑马鱼得到突变体F0，与野生型 AB 雌鱼杂交得到 F1 代，F1 代斑马鱼长大后，抽提F1后代pu.1基因组DNA进行测序，Tilling，发现一条斑马鱼Pu.1基因点突变的个体，命名为pu.1G242D，对应的F1与AB交配产生F2代，F2代自交产生pu.1G242D突变家族。通过WISH检测，确定pu.1 突变体胚胎的定向髓系细胞发育异常且是粒细胞源性的，而且结果表示pu.1G242D中的增生粒细胞为不成熟粒细胞。pu.1G242D突变体中，血细胞中不成熟的髓系细胞增生与MDS和AML相应的血液表型一致。并且发现大部分髓系细胞被限制在突变体斑马鱼的肾脏中。通过肾髓与外周采血后的瑞氏-吉姆萨染色，成年pu.1G242D突变体斑马鱼的肾髓血中累积的髓系细胞大多数都是未成熟的髓系细胞，外周血中，不成熟的髓系细胞数量也有累积。最后使用MDS和AML病人的临床常用化学药物阿糖胞苷（cytarabine (ara-C)，Pfizer，Cytosar）和柔红霉素（daunorubicin (DNR)，Pfizer，Daunoblastina）对pu.1G242D突变体进行有效性评估，发现阿糖胞苷而非柔红霉素可以缓解pu.1G242D突变体中髓系细胞的增生，这样的结果与临床上阿糖胞苷通过干扰白细胞的S期增生来缓解急性髓细胞白血病的病程、减轻其白血病症状的原理相符合。

图1.TILLING筛选得到pu.1G242D突变体

利用ENU诱变成功的斑马鱼F0 代雄鱼编号并与野生型 AB 雌鱼杂交得到 F1 代。F1代斑马鱼长大后，抽提F1后代pu.1基因组DNA进行测序。发现一条斑马鱼Pu.1基因外显子6上的碱基G变为A，导致编码的蛋白序列的第242位的甘氨酸（G）被天冬氨酸（D）取代，命名为pu.1G242D突变体，对应的F1与AB交配产生F2代，F2代自交产生pu.1G242D突变家族。

图2.pu.1G242D突变体定向髓系发育异常

通过WISH检测了3dpf的野生型和pu.1G242D突变体斑马鱼的胚胎中早期髓系细胞特异性的标记物c/ebpα、粒细胞标记基因cebp1、myeloperoxidase (mpx)和lysozyme C (lyz)、巨噬细胞的特异性标记基因的表达mfap4。与野生型相比，3dpf的pu.1G242D突变体胚胎的尾部造血组织（CHT）中，c/ebpα、cebp1、mpx、lyz的表达明显增加，这表明髓系细胞和粒细胞数量增多，巨噬细胞数目降低，证明了pu.1G242D突变体胚胎中增生的髓系细胞是粒细胞源性的。同时，还对3dpf的野生型和pu.1G242D突变体斑马鱼进行了SB染色，与野生型相比，大多数pu.1G242D突变体CHT区域的SB信号小而微弱。结合cebp1主要在未成熟的粒细胞中表达的事实，SB染色结果表明这些cebp1+SB+ 的髓细胞是未成熟的粒细胞。为了验证这一结论，对中性粒细胞特异性髓过氧化物酶（myloperoxidase，mpx）的活力（peroxidase activity）进行测定，结果表明，与野生型相比，在pu.1G242D突变体中过氧化物酶的活力显著降低，这说明增生的中性粒细胞是不成熟的。通过在8dpf的野生型和pu.1G242D突变体斑马鱼的肾髓中进行SB染色，观察到在定向造血早期，大部分增加的髓系细胞被限制在突变体斑马鱼的肾脏中。上述实验结果表明，在pu.1G242D突变体中，血细胞中不成熟的髓系细胞增生与MDS和AML相应的血液表型一致。

图3 pu.1G242D突变体模拟MDS和AML表型

表1在pu1G242D突变体和WT对照组的肾脏血和外周血中细胞系的分布

通过肾髓采血和外周采血后对样品进行瑞氏-吉姆萨染色实验，实验结果表明，在成年pu.1G242D突变斑马鱼的肾髓中，增生的髓系细胞聚集，而外周血中并没有这种表型。通过血细胞的形态和染色的不同，人工将血细胞分为祖细胞、淋巴细胞、红细胞以及白细胞并且计数。计数结果表明，与野生型相比，在18个月的pu.1G242D突变体斑马鱼的肾髓血中，髓系细胞增加了23%，淋系细胞减少了20%，且肾髓血中累积的髓系细胞大多数都是未成熟的髓系细胞，外周血中，不成熟的髓系细胞数量也有累积。

图4 pu.1G242D突变体对白血病药物的反应

通过SB染色实验，计算SB+的细胞数量来确定粒细胞的数量，可以显示阿糖胞苷而非柔红霉素可以缓解pu.1G242D突变体中髓系细胞的增生。这样的结果与临床上阿糖胞苷是通过干扰白细胞的S期增生来缓解急性髓细胞白血病的病程、减轻其白血病症状的原理相符合。

本发明的研究结果表明，在斑马鱼pu.1G242D突变体中，3dpf或者更早，不成熟的髓系细胞就在CHT组织中增多。pu.1G242D突变体在从胚胎到成年的过程中，肾髓血和外周血中也表现出明显的髓系细胞增多。这种造血紊乱与MDS和AML表型相似。进一步地，对由增生增多引起的MDS和AML有效的化学治疗同样对pu.1G242D突变体的白血病症状有效。由此，pu.1G242D斑马鱼可以作为人体内抗MDS和AML的候选药物的大规模筛选的动物模型。特别地，pu.1G242D斑马鱼可以作为人体内抗由人类Pu.1基因的突变引起的MDS和AML的候选药物的大规模筛选的动物模型。