博来霉素多次染毒诱导C57BL/6J小鼠肺纤维化模型

一、 疾病概述

特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种慢性、进行性、纤维化性间质性肺疾病，病变局限在肺脏，好发于中老年人群，其肺组织学和/或胸部高分辨率CT（HRCT）特征性表现为普通型间质性肺炎（UIP），病因不清。按病程有急性、亚急性和慢性之分，本病多为散发，据统计，每年整体人群中的患病率约（2～29）/10万，且呈逐渐增长趋势，估计以每年11%的比例增长。在美国特发性肺纤维化患者大约有100000人，欧盟地区大约有110000人，而且每年欧盟地区新增IPF患者35000人。日本每年整体人群中的IPF患病率约（2.23～10）/10万，实际值远高于这个数目。我国作为一个老龄化严重的国家，目前IPF患病人数也是逐年增加，保守估计至少在50万左右。作为一种慢性间质性肺病，IPF起病隐匿、病情逐渐加重，也可表现为急性加重。IPF诊断后的平均生存期仅2.8年，死亡率高于大多数肿瘤，IPF被称为一种“类肿瘤疾病”。

2018年5月11日，国家卫生健康委员会等5部门联合制定了《第一批罕见病目录》，特发性肺纤维化被收录其中。

（一）病因

  IPF病因不明，发病机制亦未完全阐明，但有足够证据表明与免疫炎症损伤有关。不同标本所显示的免疫炎症反应特征不尽一致，周围血所反映出的是免疫异常比较突出，而支气管肺泡灌洗液显示炎症反应为主，而肺局部组织的异常又有所不同。因此在评估各种研究资料需要考虑到这种差异。目前认为，肺泡上皮细胞损伤和异常修复是导致肺纤维化的主要机制。损伤发生后，修复过程中不能完成正常的再上皮化过程，进而导致肺泡-毛细血管损伤。这一过程诱发细胞因子产生，成纤维细胞表面表达细胞因子受体，在细胞因子作用下聚集到损伤部位并增殖。

（二）临床表现

  约15%的IPF病例呈急性，因上呼吸道感染就诊而发现进行性呼吸困难加重，多于6个月内死于呼吸循环衰竭。绝大多数IPF为慢性型(可能尚有介于中间的亚急性型)，虽称慢性平均生存时间也只有3.2年。慢性型似乎并非急性型演变而来，确切关系尚不了解。

1.主要症状

（1）呼吸困难劳力性呼吸困难并进行性加重、呼吸浅速可有鼻翼搧动和辅助肌参与呼吸，但大多没有端坐呼吸。

（2）咳嗽、咳痰早期无咳嗽，后可有干咳或少量黏液痰，易有继发感染。出现黏液脓性痰或脓痰，偶见血痰。

（3）全身症状可有消瘦、乏力、食欲不振、关节酸痛等，一般比较少见，急性型可有发热。

2.常见体征

（1）呼吸困难和发绀。

（2）胸廓扩张和膈肌活动度降低。

（3）两肺中下部Velcro啰音，具有一定特征性。

（4）杵状指趾。

（5）终末期呼吸衰竭和右心衰竭相应征象。

（三）分类

根据2013年发表的美国胸科学会/欧洲呼吸学会有关特发性间质性肺炎（IIPs）的国际多学科分类，IIPs分为主要的IIPs、罕见的IIPs和不能分类的IIPs。主要的IIPs有6种类型，包括IPF、特发性非特异性间质性肺炎（iNSIP）、呼吸性细支气管炎伴间质性肺疾病（RB-ILD）、脱屑性间质性肺炎（DIP）、隐原性机化性肺炎（COP）、急性间质性肺炎（AIP）。少见的IIPs有2种类型，包括特发性淋巴细胞性间质性肺炎（iLIP）、特发性胸膜肺实质弹力纤维增生症（iPPFE）。IPF是主要的特发性间质性肺炎中最为常见的一种类型。

（四）检查

1.影像学检查

 （1）常规X线胸片摄片技术须注意穿透条件适当，应用中度增感屏，聚焦要小。早期肺泡炎X线上不能显示异常；随病变进展，X线表现出云雾状、隐约可见微小点状的弥漫性阴影，犹如磨玻璃。进一步进展则见纤维化愈趋明显，从纤细的网织状到粗大网织状，或呈网织结节状。晚期更有大小不等的囊状改变，即蜂窝肺。肺容积缩小，膈肌上抬，叶间裂移位。

 （2）CT对比分辨率优于X线，应用高分辨CT（HRCT）可进一步提高空间分辨率，对于IPF的诊断，特别是早期肺泡炎与纤维化鉴别及蜂窝肺的发现极有帮助。

 （3）核素IPF常有肺泡毛细血管膜通透性增高。核素技术吸入99mTc-DTPA气溶胶测定肺上皮通透性（LEP）可见T1/2缩短，有助于早期发现和诊断间质性肺病，对于IPF并无特异性。

2.肺功能检查

IPF的典型肺功能改变包括限制型通气损害、肺容量缩小、肺顺应性降低和弥散量降低。严重者出现PaO2下降和PA-aO2增宽。肺功能检查与影像学技术有助于早期诊断，特别是运动试验在影像学异常出现前即有弥散量降低和低氧血症。肺功能检查可作动态观察，对病情估价很有帮助，用于考核疗效可能也是有用的。同样，IPF的肺功能异常没有特异性，无鉴别诊断价值。

3.支气管肺泡灌洗

支气管肺泡灌洗回收液细胞总数增高，而中性粒细胞比例增加是IPF比较典型的改变，对诊断有帮助。目前仍主要用于研究。

4.肺活检

IPF早、中期的组织学改变有一定特点，而间质性肺病病因多包括许多有明确病因可寻者，因此肺活检对于本病确诊和活动性评价十分有意义。首选应用纤支镜作TBLB，但标本小，诊断有时尚有困难。必要时宜胸腔镜或开胸肺活检。

（五）诊断

1. 临床表现

发病年龄多在中年及以上，男性多于女性。起病隐袭，主要表现为干咳、进行性呼吸困难，活动后明显。多数患者双下肺可闻及吸气末爆裂音或捻发音，超过半数可见杵状指（趾）。终末期出现紫绀、肺动脉高压、肺心病和右心功能不全。

2. 胸部HRCT

胸部HRCT是诊断IPF的必要诊断手段。胸片对于疑似IPF患者的诊断价值明显地低于HRCT，不应该作为IPF的诊断依据。IPF的胸部HRCT以网格影和蜂窝肺为主要特征，经常伴有牵拉性支气管扩张[2]，其中蜂窝肺是诊断肯定UIP型重要的依据。少见磨玻璃影，且通常比网格影范围小。胸部HRCT典型的UIP分布特征是以双下肺和外带分布。

合并胸膜异常，如胸膜斑、钙化、显著的胸腔积液时，多提示为导致UIP型病变由其他疾病引起。微结节、气体陷闭、非蜂窝肺的囊腔影、广泛的磨玻璃影、实变，或沿支气管血管为著的分布特点，均提示其他的诊断。

3. 组织病理学检查

IPF的特征性组织病理学改变是普通型间质性肺炎，其主要病变为纤维化，病变的程度及分布不一致，低倍显微镜下观察，同时可见瘢痕纤维化区域伴有蜂窝肺改变，和病变较轻甚至正常肺组织区域[2]。这些组织病理改变通常以胸膜下和间隔旁肺实质为著。通常炎症较为轻微，可有少量淋巴细胞和浆细胞间质浸润，伴2型肺泡上皮细胞和细支气管上皮细胞增生。纤维化区域主要由致密的胶原纤维组成，可见散在分布的成纤维细胞灶。蜂窝肺区域由囊性纤维化的气腔组成，通常衬附着细支气管上皮细胞，腔内有粘液和炎症细胞填充。肺纤维化区域和蜂窝肺病变区域中，肺脏间质可见平滑肌增生。

4. 诊断标准

（1）除外已知病因所致的间质性肺疾病，如职业接触、室内外环境暴露、结缔组织病和药物性肺损害等。

（2）未行外科肺活检的患者，胸部HRCT表现为肯定UIP型。

（3）行外科肺活检的患者，结合HRCT和外科肺活检符合特定的类型。

（六）治疗

1. 药物治疗

(1) 吡非尼酮 吡非尼酮是2015年美国胸科学会/欧洲呼吸协会/日本胸科协会/拉丁美洲胸科协会联合发布的《特发性肺纤维化临床治疗推荐指南》中个推荐用于治疗的两个药物之一， IPF患者经吡非尼酮连续服药治疗52周后，能够减缓患者的肺功能指标如FVC和DLCO的下降，延长患者无进展生存期（PFS），同时降低患者死亡风险。

(2) 尼达尼布：尼达尼布是2015年美国胸科学会/欧洲呼吸协会/日本胸科协会/拉丁美洲胸科协会联合发布的《特发性肺纤维化临床治疗推荐指南》中推荐等级最高（条件推荐）的两大药物之一。

2. 非药物治疗

① 戒烟：大多数IPF患者是吸烟者，吸烟与疾病的发生具有一定的相关性。吸烟者，必须劝导和帮助患者戒烟。②氧疗。③机械通气。④肺康复。⑤肺移植。

参考文献

1.曹孟淑, 蔡后荣. 2018年特发性肺纤维化（IPF）诊断指南解读.中国实用内科杂志.2019.35(9):431-436.

2.关于公布第一批罕见病目录的通知．医政医管局[引用日期2018-06-11]

二、模型背景

1、实验动物背景信息

利用C57BL/6J小鼠制备肺纤维化模型。

2、研究背景

特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis ，IPF）是一种原因不明、以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱最终导致肺间质纤维化为特征的慢性疾病 【3, 4】，且预后极差，动物肺纤维化模型在肺纤维化机制及其防治研究中非常重要。二氧化硅 【5】、石棉、博来霉素 【6】（BLM）等多种物质都能诱导肺纤维化，最常用BLM诱导肺纤维化模型 【7】，BLM可经鼻给药、气管内给药、尾静脉注射、腹腔注射，气管给药是最常用的方式【8】，气管内给药又可分为直接支气管插管和气管滴注。有文献报道BLM单次给药模型在给药六周之后，小鼠肺损伤部位有明显修复 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 【9】，与人类肺纤维化疾病的发展过程不同；病理学表现也不相同，人肺纤维化疾病的肺损伤部位细胞外基质的沉积增多，中性粒细胞的炎症反应不突出 【10】，而单次给药肺纤维化模型中常有明显的嗜中性粒细胞细胞的炎症反应，并且有文献显示经博来霉素单次给药肺纤维化模型筛选出来的药物治疗方案，在临床上大多数都是无效的 【11】。基于以上因素，我们在参阅相关文献后，拟采用BLM气管滴注多次给药方式造成小鼠肺持续性损伤，希望制备更符合人体IPF发病情况的博来霉素肺纤维化模型。

参考文献

[1]Demedts M，Costabel U. ATS/ERS international multidisciplinaryconsensus classification of the idiopathic interstitial pneumonias [J].EurRespir J，2002，19（5）：794-796.

[2]Huang X，Wang W，YuanH，et al. Sunitinib，aSmall -Molecule Kinase Inhibitor，AttenuatesBleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis in Mice [J]. Tohoku J Exp Med，2016，239（4）：251-261.

[3]Moll S，Chaykovska L，MeierM，et al. Targeting the epithelial cells in fibrosis：a new concept for an old disease [J]. Drug Discov Today，2013，18（11/12）：582-591.

[4]Costabel U. Idiopathic pulmonary fibrosis in 2011：keyupdates on guidelines and therapeutics Concluding remarks [J]. RespiratoryResearch，2013，14Suppl 1：S8.

[5]Latoche JD，Ufelle AC，FazziF，et al. Secreted Phosphoprotein 1 and Sex-SpecificDifferences in Silica-Induced Pulmonary Fibrosis in Mice [J]. Environ HealthPerspect，2016，124（8）：1199-1207.

[6]Yilmaz O，Oztay F，KayalarO. Dasatinib attenuated bleomycin -induced pulmonary fibrosis in mice [J].Growth Factors，2015，33（5/6）：366-375.

[7]Latta VD，Cecchettini A，RySD，et al. Bleomycin in the setting of lung fibrosisinduction：From biological mechanisms to counteractions [J].Pharmacol Res，2015，97：122-130.

[8]Degryse AL，Lawson WE. Progress toward improving animal models foridiopathic pulmonary fibrosis [J]. Am J Med Sci，2011，341（6）：444-449.

[9]Chung MP，Monick MM，HamzehNY，et al. Role of repeated lung injury and geneticbackground in bleomycininduced fibrosis [J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2003，29 （3 Pt 1）：375-380.

[10]Moore BB，Hogaboam CM. Murine models of pulmonary fibrosis [J]. AmJ Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，294（2）：L152-160.

[11]Degryse AL，Tanjore H，XuXC，et al. Repetitive intratracheal bleomycin models severalfeatures of idiopathic pulmonary fibrosis [J]. Am J Physiol Lung Cell MolPhysiol，2010，299（4）：L442-452.

1实验动物C57BL/6J小鼠45 只（SPF 级），体重20--22g，10-12周，购自北京华阜康生物科技股份有限公司［动物合格证：SCXK（京）2015-0035］，饲养和实验在中国医学科学院医学实验动物研究所动物房屏障环境内进行，温度为20-26℃，相对湿度50%-60%。

2试剂 博来霉素（BLM）：注射用盐酸博来霉素，日本化药株式会社；盐酸氯胺酮注射液：沈阳市兽药厂，兽药字（2011）060022668；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒：碧云天；核固红染色液（0.5%）：北京雷根生物技术有限公司。

3模型建立14周龄的雄性小鼠按体重随机分为未处理组（n=5）和处理组（n=40），处理组气管滴注BLM溶液（0.4 mg/ ml，每只100ul），未处理组小鼠不经任何处理，处理组小鼠用注射用盐酸氯胺酮150mg/kg腹腔注射麻醉，固定，暴露声门，用接套管的1ml注射器气道给药。两星期给药一次，给药8次，第一次给药为0周，在0.5个月、1个月、2个月、4个月时分别取肺组织，称重，取右肺中叶做冰冻切片，剩余肺组织10%中性甲醛中固定制备石蜡切片做HE染色、Masson染色。

4 HE染色肺组织10%中性甲醛中固定24h，常规脱水、石蜡包埋后，切片5um，进行苏木素—伊红染色，普通光学显微镜（BX50，Olympus, Japan）下观察肺组织病理学改变，病理学镜检人员进行单盲评分。

5 Masson染色 肺组织石蜡切片脱蜡，蒸馏水冲洗，Masson染色复合液染色5min，自来水冲洗，0.2%醋酸浸洗，自来水冲洗，1%磷钨酸，水洗后亮绿染色液染色15min，水洗，0.2%醋酸浸洗，水洗片刻，脱水、透明、固封。

6 肺系数小鼠在BLM处理0.5个月、1个月、2个月、4个月四个时间点分别取肺组织，称重，计算肺系数。肺系数=肺组织重量（mg）/小鼠体重（g）。

7 冰冻切片 小鼠在0.5个月、1个月、2个月、4个月四个时间点分别取右肺中叶，速冻后，将肺组织浸没在适量的包埋剂中，用冰冻组织切片机制作8um的切片。

8 细胞衰老β-半乳糖苷酶染色方法 肺组织冰冻切片按试剂盒说明操作。先用试剂盒中固定液固定15min，PBS洗3次，每次3min，配置染色液，滴加到冰冻切片上，37℃培养箱（无CO2）过夜后，PBS洗一遍，核固红（0.5%）复染15min，使细胞核变为红色，便于区分细胞。

9 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，结果以均数±标准差（ ）表示，多组间比较采用单因素方差分析和t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

1博来霉素多次给药对小鼠体重的影响

雄性C57BL/6J小鼠随机分为未处理组和处理组，处理组第1次染毒为0周，未处理组和处理组每周称重一次。

图1：博来霉素对小鼠体重的影响

结果发现：未处理组小鼠体重呈逐渐上升趋势。与未处理组小鼠比较，BLM第一次给药（0周）后，处理组小鼠体重下降趋势，但无显著性差异（P>0.05），在1周后逐渐回升；在第5周时与未处理组小鼠体重未见明显差异，随后体重与未处理组体重增长趋势一致；在14周时体重超过未处理组，15周、16周、17周体重均高于未处理组，无显著性差异（P>0.05）（图1）。

2博来霉素多次给药过程中肺系数的变化

小鼠在染毒0.5个月、1个月、2个月、4个月四个不同时间点取材，分离肺组织，称重，计算肺系数。

图2：BLM处理不同时间点的肺系数

注：*与未处理组相比，P<0.05。

处理组小鼠0.5个月、1个月、2个月、4个月的肺系数均高于未处理组，与未处理组比较，1个月、2个月、4个月无显著性差异（P>0.05），2周时肺系显著高于未处理组（P<0.05）；且0.5个月时高于1个月、2个月、4个月的肺系数，但无显著性差异（P>0.05）（图2）。

3 博来霉素多次给药肺组织病理学改变

根据HE染色结果，对肺组织病理学评分：由一个0—12 分范围组成，每张切片，3 个分类评价指标 【12】：肺泡间隔增宽、肺泡腔内纤维化渗出的严重度、血管周围炎细胞浸润的程度，每种分类又分为：0 分为正常；1 分为轻度；2 分中度；3分重度；4 分极重度。合并后记分。

图3：肺组织HE染色（×100）

注：A 未处理组，B 0.5个月，C 1个月，D 2个月，E 4个月

图3显示，BLM给药过程中，在BLM第一次给药后0.5个月、1个月、2个月、4个月这四个时间点，肺组织肺泡腔胞浆渗出逐渐减少、炎细胞浸润依次减弱、肺泡间隔差异不明显。

从总分来看，在0.5个月、1个月、2个月、4个月四个时间点中0.5个月时分数最高，与未处理组相比，0.5个月、1个月、4个月评分具有显著性差异（P<0.05）。从单项评分来看，1）肺泡间隔增宽：四个时间点中0.5个月时分数较高，1个月、2个月、4个月评分相对稳定，与未处理组相比，0.5个月、2个月、4个月评分具有显著性差异（P<0.05）；2）肺泡腔内渗出：0.5个月时分数高于其他三个时间点，与未处理组相比，0.5个月、4个月具有显著性差异（P<0.01）；3）血管周围炎细胞浸润：四个时间点中0.5个月时分数最高，与未处理组相比具有显著性差异（P<0.01），1个月、2个月、4个月评分呈逐渐递减的趋势，4个月时与未处理组炎细胞浸润水平接近。

4 博来霉素多次给药肺组织胶原沉积的变化

图4：肺组织Masson染色（×100）

注：A 未处理组，B 0.5个月，C 1个月，D 2个月，E 4个月

与未处理组比较，0.5个月时已出现蓝绿色的胶原纤维，1个月、2个月、4个月胶原纤维持续存在（图4）。

5博来霉素多次给药对肺组织衰老细胞的影响

未处理组和BLM给药4个月的肺组织冰冻切片进行SA β-gal染色，衰老细胞的胞浆为蓝色。

图5：SA β-gal染色（×100）

注：A 未处理组，B 4个月

SA β-gal染色结果显示，在染毒四个月时的冰冻切片，蓝色细胞明显比未处理组多，说明小鼠肺组织中出现较多衰老细胞（图5）。

博来霉素系细胞毒性药物。人员配制及使用时注意防护，器物按规定处理。

总结该模型鉴定和评价的技术方法和指标体系；分析该模型与国内外现有模型的异同；讨论该模型的技术关键点及难点、创新性和比较医学应用价值。

BLM单次给药肺纤维化模型易于操作、可重复性强，在阐明肺纤维化与细胞因子、生长因子 【6】和信号通路的关系上具有重要作用，如TGF-β在肺纤维化过程中的作用 【13】。但该模型并没有复制出人IPF进展慢、不可逆这两个重要特点 【14】，利用此模型筛选出的200多种治疗手段，在临床转化后没有取得预期后果【15】，该模型需要进一步优化。

BLM多次给药造成小鼠肺持续性损伤，本实验观察了造模过程中小鼠的动态变化过程，与未处理组相比，小鼠体重相对稳定，肺局部反应持续存在。实验结果证明，相比BLM单次给药模型，多次给药肺纤维化模型具有肺纤维化不可逆、炎症反应明显减弱等明显的优势，多次给药模型更符合临床人类肺纤维化疾病的发展。因此，我们希望能利用多次给药模型进行抗纤维化药物筛选及药效学评价，为临床有效治疗肺纤维化提供更多的参考。

目前，肺纤维化发病机制尚不明确【16】，之前认为是由慢性炎症引起肺纤维化 ADDIN EN.CITE ADDINEN.CITE.DATA 【17】，通过抑制炎症反应阻止肺纤维化的发展进程未取得预期效果。近年来的研究发现肺泡上皮细胞慢性损伤在肺纤维化发生过程中起重要作用 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 【18】，相比单次给药，多次给药模型小鼠炎症反应减少且有明显的肺泡上皮细胞增生 【19, 20】，这是多次给药模型又一个重要优势，肺纤维化机制的研究中具有重要意义，并能用于上皮-间质转化（epithelial-mesenchymaltransition ，EMT）肺重塑和修复的评估【19】。

关于BLM肺纤维化模型的机制，之前的观点是BLM诱导DNA断裂产生自由基诱导氧化应激反应【11】，引起细胞凋亡或坏死，产生炎症反应和纤维化。K.Aoshiba 【21】认为BLM诱导肺泡Ｉ型细胞死亡，具有干细胞特性的肺泡II型细胞试图增殖分化进行修复，但BLM造成II型细胞损伤，致使其增殖能力受到影响，修复过程受阻，纤维母细胞激活后迁移到上皮细胞间缺陷处，从而导致肺纤维化。肺泡II型细胞的损伤及过度增殖导致细胞衰老，可能是肺纤维化发生的一种新的机制。细胞衰老β-半乳糖苷酶染色结果也证明肺纤维化处理组4个月的肺组织中有细胞出现衰老的现象。通过清除衰老细胞是否可以治疗肺纤维化疾病也许是肺纤维化疾病的一个新治疗方向。