Igfbp5基因敲除肺结核小鼠模型

一、疾病概述 肺结核（Pulmonary tuberculosis，PTB）是世界高死亡率的严重传染病之一。PTB是由各种分支杆菌菌株引起的，结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）大多在人类中观察到。根据世界卫生组织（世卫组织）的报告，2017年全世界有1000万新病例PTB疾病和150万例死亡（世卫组织，2018年）。 据估计，世界人口的三分之一是潜伏性感染的Mtb，其中5%至10%会发展为活动性结核病。主要症状为有较密切的结核病接触史，起病可急可缓，多为低热（午后为著）、盗汗、乏力、纳差、消瘦、女性月经失调等；呼吸道症状有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、不同程度胸闷或呼吸困难。肺部体征依病情轻重、病变范围不同而有差异，早期、小范围的结核不易查到阳性体征，病变范围较广者叩诊呈浊音，语颤增强，肺泡呼吸音低和湿啰音。晚期结核形成纤维化，局部收缩使胸膜塌陷和纵隔移位。在结核性胸膜炎者早期有胸膜摩擦音，形成大量胸腔积液时，胸壁饱满，叩诊浊实，语颤和呼吸音减低或消失。尽管有微生物治疗，多达一半的结核病幸存者仍具有某种形式的持续性肺功能障碍。肺功能障碍，从轻微异常到严重气喘，可增加呼吸道原因死亡的风险。快速诊断和有效治疗对于控制PTB的传播和降低其死亡率非常重要。尽管对PTB的机理研究开展了了大量工作，但PTB进展中的分子机制仍然不清楚。二、模型背景1、Igfbp5基因信息• 敲除基因名称（NCBI号）：16011• 敲除基因NCBI网址链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/16011• 敲除基因名称（MGI号）：Igfbp5（MGI: 96440）• 敲除基因Ensembl网址链接：• http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?g=ENSMUSG00000• 026185;r=1:72857932-72874884• 方案针对的转录本（Ensembl号）：ENSMUST00000027377.8• 方案敲除的exon：全部编码区2、实验动物背景信息 所采用的小鼠品系为C57BL/6。 来源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57号与雄鼠52号交配而得C57BL1937年从C57BL分离出C57BL/6和C57BL/10两个亚系。1985年从Olac引到中国医学科学院医学实验动物研究所。 毛色：黑色。 主要特性：①乳腺肿瘤自然发生率低，化学物质难以诱发乳腺和卵巢肿瘤。②12%有眼睛缺损;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%为小眼或无眼。用可的松可诱发腭裂，其发生率达20%。③对放射物质耐受力中等;补体活性高;较易诱发免疫耐受性。④对结核杆菌敏感。对鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干扰素产量较高。⑥嗜酒精性高，肾上腺素类脂质浓度低。对百日咳组织胺易感因子敏感。⑦常被认作"标准"的近交系，为许多突变基因提供遗传背景。主要用途：是肿瘤学、生理学、免疫学、遗传学研究中常用的品系。3、研究背景 胰岛素生长因子结合蛋白（Insulin growth factor binding proteins, IGGBPs）, 系胰岛素样生长因子（insulin growth factors, IGFs）的结合蛋白家族，通过高亲和力与IGFs结合调控IGFs发挥生物学功能[1]。研究发现，IGFs 在促进细胞的增殖与分化，调节免疫功能等方面发挥重要的生物作用；而现有的七种IGFBP与IGFs结合，延长IGFs的半衰期，增强或者抑制IGFs的生物学作用[2]。IGFBP5, 分子量为28~30 KD，在大量细胞中均有表达，与IGF1与IGF2有较高的亲和力。大量研究发现，IGFBP5与肺组织的发育及部分疾病进程相关。IGFBP5从妊娠第15天开始表达，主要集中在近端气道上皮细胞、质间充质和周围血管的间充质，且随着妊娠的进行而增加，发现IGFBP5在胎儿肺发育过程中至关重要[3] [4]。另有研究报道[5]，IGFBP-5在体外和体内均可诱导胞外基质成分（例如胶原蛋白和纤连蛋白）的产生, 还可诱导原代人肺成纤维细胞迁移而加速肺纤维化进程，可能与MAPK信号通路的激活相关。此外，有相关研究发现miR-19a-19b-20a[6]，热休克蛋白70[7]在肺纤维化中的作用可能与介导了IGFBP5相关。大量研究表明IGFBP5与肺癌的发生及患者预后情况密切相关。有研究[8]发现在肺鳞状细胞癌（SCC）中差异表达的基因，IGFBP5在肺肿瘤组织和十个正常支气管上皮组织中存在显著的表达差异。有研究采用生物信息学分析发现[9]： IGFBP5是转移性骨肉瘤中表达下调最显著的基因之一，深入过表达、敲低实验验证IGFBP5抑制了骨肉瘤体外细胞增殖，迁移和侵袭，且敲低IGFBP5后能逆转肿瘤的进程。有研究发现[10] circPIP5K1A通过靶向miR-661 / IGFBP5轴促进了卵巢癌的发展，间接表明IGFBP5在肿瘤中的作用及成为治疗靶点的临床意义。 因此，本课题与采用模型，探究IGFBP5在肺结核疾病中的潜在作用及分子机制，旨在为肺结核筛选疾病分子标志物与寻求潜在治疗靶点。参考文献：1. Stiles, A.D. and A.J. D'Ercole, The insulin-like growth factors and the lung. Am J Respir Cell Mol Biol, 1990. 3(2): p. 93-100.2. Cohick, W.S. and D.R. Clemmons, The insulin-like growth factors. Annu Rev Physiol, 1993. 55: p. 131-53.3. Retsch-Bogart, G.Z., et al., Cellular localization of messenger RNAs for insulin-like growth factors (IGFs), their receptors and binding proteins during fetal rat lung development. Am J Respir Cell Mol Biol, 1996. 14(1): p. 61-9.4. Price, W.A., et al., Insulin-like growth factor binding protein production and regulation in fetal rat lung cells. Am J Respir Cell Mol Biol, 1993. 8(4): p. 425-32.5. Yasuoka, H., Y. Yamaguchi, and C.A. Feghali-Bostwick, The pro-fibrotic factor IGFBP-5 induces lung fibroblast and mononuclear cell migration. Am J Respir Cell Mol Biol, 2009. 41(2): p. 179-88.6. Souma, K., et al., Lung fibroblasts express a miR-19a-19b-20a sub-cluster to suppress TGF-beta-associated fibroblast activation in murine pulmonary fibrosis. Sci Rep, 2018. 8(1): p. 16642.7. Sellares, J., et al., Intracellular Heat Shock Protein 70 Deficiency in Pulmonary Fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol, 2019. 60(6): p. 629-636.8. Liu, Y., et al., Identification of genes differentially expressed in human primary lung squamous cell carcinoma. Lung Cancer, 2007. 56(3): p. 307-17.9. Su, Y., et al., Insulin-like growth factor binding protein 5 suppresses tumor growth and metastasis of human osteosarcoma. Oncogene, 2011. 30(37): p. 3907-17.10. Sun, Y., et al., circPIP5K1A serves as a competitive endogenous RNA contributing to ovarian cancer progression via regulation of miR-661/IGFBP5 signaling. J Cell Biochem, 2019. 120(12): p. 19406-19414.

1. 项目策略图

此模型采用CRISPR/Cas9技术对Crtc1基因进行基因编辑，原理示意图如下：

2. 项目策略概述

利用CRISPR/Cas9技术，设计并体外转录gRNA, 将Cas9、gRNA同时注射到小鼠的受精卵中。Cas9蛋白在gRNA引导下结合到靶位点进而造成DNA双链断裂，从而实现靶位点碱基序列缺失，实现基因敲除。

3. gRNA序列信息

gRNA1: CACGCAAGTCCCAATTGCG (5’ – 3’), PAM: AGG.

gRNA2: CCCTTGCTAGAGATTCCG (5’ – 3’), PAM: AGG.

小鼠鉴定结果解读：

24#, 26#, 27#, 29# KO- PCR 反应可以获得~700bp条带； WT- PCR 反应可以获得324bp 条带，为杂合子。注：数字为鼠尾号，WT为C57BL/6J野生鼠，N为Nagative空白对照，M为DNA Marker。

① 24#，26#，27#，29#：-12678bp，+13bp/wt，编码区完全删除，KO 阳性 agattttaagcaaaggggggaaaattaagc-----12678bp------TAGGGTCAGAATTctagacccctcaccctcctctcctcttacc

② 31#，34#：-12536bp/wt，编码区完全删除，KO 阳性 ccaccacccccaattctgacccgatcccgc-----12536bp---agccagcagtgtggatggctagacccctca

③ 32#，33#：-12571bp/wt，编码区完全删除，KO 阳性 tccaccaccacccccaattctgacccgatc----12571bp-----cctcctctcctcttacccaagtgcagggtg

模型动物饲养在武汉大学人民医院动物房SPF级动物实验室，实验动物使用许可证SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特点

门采用专用净化密闭门并配备观察窗。单向走道呈顺时针走向设计。屏障系统内共有大鼠饲养室1间，小鼠饲养室3间，隔离观察室1间，实验准备室1间，洁物存放室1间，清洗消毒室1间。此外，屏障系统外配有监控室、机房和配电室等。

（2）设计参数

室内温度：20～26°C；日温差：≤4°C；相对湿度：40%～70%；换气次数：15～20次/h；气流速度：≤0．2m/s；压强梯度：20～50Pa；空气洁净度：7级；菌落数：≤3个/皿；氨浓度：≤14mg/m3；噪声：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；动物照度：15～20lx；昼夜明暗交替时间：12/12h。

（3）通风和空调系统

动物实验室采用全新风中央空调通风系统。空气经过初、中、三级过滤器后进入实验室内环境。

（4）照明系统

一更、淋浴、二更、气闸、清洁走道、洁物存放处、污物走道、缓冲间和清洗消毒间、动物饲养室、实验准备间、隔离观察室和功能实验室等安装有手动和自动开关，根据实际需要，调节控制室内照明灯。未启用房间、清洁走道、洁物存放处、污物走道等在每日中午12点和晚上8点开启紫外线灯照射1h。

（5）通讯系统

因为SPF级动物实验室的环境和设施具有特殊要求，人员进入后不能随意出入，而室内外的联系又十分重要，故室内各房间均安装内部电话机，按照房间顺序编排电话号码，各室内电话可相互连通，并均与监控室总机保持联系，保证实验室内外信息的及时沟通。

（6）监控系统

对SPF级动物实验室的出入口、走道、实验动物饲养室、功能操作室等重要位置均安装了可作270°旋转的摄像机，能够及时了解设施的运行状态；也能有效督促实验人员执行科学的操作规程，避免人为因素造成室内环境和设施的污染；并对整个实验期间的动物状态和反应进行观察，减少对动物的滋扰。

（7）供水系统

SPF级实验动物饮用水以纯净水为宜。本实验室采用管道供水，将处理后的纯净水用塑胶管道输送到屏障系统内实验准备室，设置接水槽，为实验动物供应灭菌的饮用水和屏障系统内用水。要经常更换和清洗输水管道，清洗笼具的用水添加适当比例的84消毒液。

（8）供电系统、警报系统和消防设施

SPF级动物实验室要求全天候不间断供风和供电，如果出现故障，不能及时发现和处理，就可能导致环境设施的污染、动物感染或死亡，造成严重后果。因此应对SPF级动物实验室使用独立稳定的供电系统，并配备有应急电源。在中央空调机房控制室安装风机故障警报系统，以便及时检修和维护，保证设施的安全运行。

（9）消毒灭菌设备

为防止外界物品进入SPF级动物实验室时所携带的细菌污染室内环境和造成动物交叉感染，按照不同物品的特性，进行紫外线照射消毒、渡槽消毒液消毒或专用的机动门真空灭菌器消毒。

（10）动物饲养笼具

饲养大、小鼠的笼具聚碳酸脂材料的塑胶笼具，具有高透明、耐高压、耐高温、耐酸碱等特点。通用的不锈钢笼具长、宽、高分别为40、30、20cm，适用于单笼饲养有特殊要求的实验动物，配有底盘和食槽，确保实验动物有充足的采食和活动空间，同时也保证室内环境的清洁。

（11）垫料的选择和使用

在使用塑胶垫料时，垫料是大小鼠直接接触的铺垫物，起到吸湿、保暖和造窝的作用。垫料的好坏直接影响到大小鼠术后的恢复、生长发育和繁殖性能。目前，所使用的垫料主要有玉米秸垫料、刨花垫料。

（12）饲料配制

大小鼠的生产型饲料和维持型饲料必须严格按照国家标准，进行科学配制生产。每半年检测一次饲料的微生物指标和有效营养成分指标，保证饲料的质量。

Igfbp5基因敲除小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技术的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外显子或几个总要的外显子功能区敲除掉，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。Armh4基因敲除小鼠模型为完全性基因敲除模型（KO），该模型应用范围广，可以制造针对各类疾病不同组织器官细胞的疾病模型。

CRISPR/Cas9技术的优点在于其对基因进行定位的精准编辑，在向导RNA（guide RNA，gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，细胞基因组DNA（被看成外源DNA）将被准确剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要满足几个条件。第一，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（NGG）。第二，向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。

肺结核系一种发病率高、传染性强的呼吸系统疾病，大量研究表明IGFBP5与肺组织的发育、肺纤维化和肺癌紧密相关，然而，目前暂无相关研究探讨IGFBP5在肺结核中的作用。考虑到肺结核与肺癌的关系密切，因此探究IGFBP5在肺结核疾病中的潜在作用及分子机制至关重要。