过敏性哮喘挪威褐鼠模型

一、疾病概况

过敏性哮喘（以下简称哮喘）属于I型超敏反应又被称作变态反应，病变主要表现在肺支气管，是以可逆性支气管痉挛和气道高反应性为特点的慢性炎症。病理表现为以嗜酸性粒细胞为主的炎细胞在肺组织大量浸润，杯状细胞增生、黏液过度分泌及气道重塑等。近年来，世界范围内哮喘发病率逐年攀升，对人类健康危害极大，哮喘研究日益受到重视，

作为哮喘机理及药物等研究的必备工具—动物模型发挥着重要的作用，模型的发展直接影响哮喘研究的进步。过敏性哮喘发病机制即I型超敏反应是该病模型的造模基础，在此基础上研究者根据研究目的选择不同的模型动物，卵蛋白、尘螨、花粉等不同变应原，哮喘发作、气道高反应性等不同阶段和气道阻力、Penh等不同指标检测方法及麻醉、清醒等不同动物生理状态，构建多种类型的模型。目前过敏性哮喘动物模型多样化且各有利弊，合理的选择是获得优秀研究成果的保证。

二、发病机制

I型超敏反应包括致敏和激发两个部分，致敏即机体首次接触抗原，激发即机体第二次接触抗原触发的反应。是指机体第二次接触相同抗原后，

首先被树突状细胞、B细胞上的受体识别，受体与抗原特异性结合，产生刺激B细胞活化的第一信号，然后胞吞抗原将其内化，并进行加工处理，抗原降解后产生的抗原肽与MHCⅡ类分子结合，以MHCⅡ类分子-抗原肽复合物的形式提呈给特异性Th细胞（抗原诱导CD4+T细胞分化而来的Th2细胞）识别，Th细胞活化，表达CD40L，CD40L与B细胞表面CD40结合，向B细胞提供协同刺激信号即B细胞活化的第二信号。Th2还能分泌IL-4、IL-5、IL-6促进B细胞活化增殖。B细胞活化后循两条途径分化：浆细胞和记忆细胞。浆细胞产生IgM，抗原诱导抗体向IgE转换，Th2分泌的IL-4也诱导抗体向IgE转换。IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的高亲和性IgE Fc受体结合，完成致敏过程。

抗原再次进入机体后，与致敏肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞表面上的IgE抗体结合，使膜上两个相邻的高亲和性IgE Fc受体发生相互连接，即受体通过γ链C端免疫受体酪氨酸活化基序的磷酸化作用，使Syk和Fyn酪氨酸激酶活化，通过两条途径诱导靶细胞脱颗粒、释放及合成生物活性物质：（1）使γ异构型磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C信号链活化，使胞浆内肌球蛋白轻链磷酸化，从而导致脱颗粒、释放组胺等生物活性介质；（2）活化丝裂原启动蛋白激酶信号通路，使膜磷脂胆碱分解产生花生四烯酸，进而通过环氧合酶、脂氧合酶途径合成前列腺素D2和白三烯，使烃基化磷脂分解成溶血血小板活化因子，再经乙酰转移酶作用生成血小板活化因子。引起支气管平滑肌痉挛、血管通透性增强、黏液分泌增多和炎症细胞募集等哮喘早期反应，即哮喘发作时的速发相（early-phase asthmaticresponse, EAR）， EAR发生在接触抗原数分钟内，一般持续1-2 h。50%以上的哮喘患者在EAR后会有迟发相（late-phase asthmaticresponse, LAR）出现，LAR主要是由炎症细胞如嗜酸性粒细胞、T细胞、巨噬细胞等浸润，呼吸道上皮细胞、血管内皮细胞和气道平滑肌细胞等趋化分泌炎性因子，进而加重支气管痉挛和粘膜水肿而使喘息增加，主要是炎症过程，可持续近10 h甚至更久，加重气道高反应性，从而引发咳嗽、胸闷、呼吸困难和喘息等症状

1.实验动物

雄性SPF级挪威褐鼠，6 ~ 8周龄，体重140 ~ 150 g。

2. 模型构建

1）抗原致敏

挪威褐鼠按OVA混合Al(OH)3干粉（10+100mg/只）致敏液于第0天（d 0）和第5天（d5）在每只动物背部选取2点进行皮下注射，每点均注射0.2ml。

2）抗原激发过敏反应

于致敏后第35天将挪威褐鼠一起放入雾化箱中，雾化箱放入二级生物安全柜中将5% OVA 5mL加入压缩雾化吸入机，雾化吸入10分钟完成激发。激发完成后立即将挪威褐鼠转移至体积描记器中开始记录呼吸参数，持续记录16 h。

哮喘反应（速发相和迟发相）、病理改变（包括肺炎细胞浸润和黏液分泌等）、血免疫指标（血清IgE及相关免疫细胞及细胞因子）等。

1.特异性IgE结果

由表1可以看出，除OVA 0.01组，OVA 0.1、OVA 1、OVA 10、OVA 0.1 + Al(OH)3 100、OVA 1 + Al(OH)3 100、OVA 10 + Al(OH)3 100、OVA 1 + Al(OH)3 52、OVA 1 + Al(OH)3 4、OVA 10 + Al(OH)3 gel 4组血清IgE含量与正常对照组相比均显著升高（P < 0.05），且随OVA剂量增大，IgE含量升高，加入佐剂组比单纯OVA组抗体含量高。OVA 10 + Al(OH)3 100组与OVA 10+ Al(OH)3 gel 4组的IgE含量无显著差异，均较其他组高，以OVA 10 + Al(OH)3 100组为最高。如表1、2，OVA 10组与相当于其1 % OVA含量但加入了一定佐剂的OVA 0.1+ Al(OH)3 100组产生的抗体含量相当，且滴度相同，无统计学差异。从图1模型组（OVA 10 + Al(OH)3 100组为代表），IgE含量随时间变化曲线可以看出，致敏后IgE水平呈现时间依赖性增长，在第1周内与正常对照组无明显差异，1周后IgE水平开始快速升高，在第2周内剧烈增长，2周后涨幅变缓慢呈现稳定的持续增长，在第5周达最高值，d 38时略有下降。

Fig. 1 The curve of IgEcontent changes over time

图 1 IgE含量随时间变化曲线

Tab. 1The influence of different sensitization methods to day35 IgE content

表1 不同致敏方法对d 35 IgE含量的影响

Tab. 2The IgE titer of the day 35 sera of OVA 10 and OVA 0.1 + Al(OH)3 100 groups

表2 OVA 10和OVA 0.1 + Al(OH)3 100组d 35的IgE滴度

2.哮喘发作全过程记录结果

正常对照组激发后的Penh曲线在16 h内较稳定，没有明显波动（图2A）。其Penh限值为1.14（0.90+3*0.08），大于1.14即为Penh值升高。与正常对照组相比（图2B），致敏组（OVA 10 + Al(OH)3 100组为代表）激发后Penh值立即升高，其Penh曲线在前1 h内有明显上升（图3B）。之后曲线有轻度下降，再开始剧烈上升达峰值后剧烈下降再缓慢下降至基线水平（图3A）。如表3所示，单一OVA 0.1mg至10mg致敏，激发后均出现气道反应。低剂量时仅有EAR，随剂量增加，反应加重，LAR发生的比例增加。加入Al(OH)3佐剂致敏后反应进一步加强，EAR和LAR都出现的动物可达半数以上。如表4所示，正常对照组和OVA 10 + Al(OH)3 100、OVA 10 + Al(OH)3 gel 4组的EAR峰值和LAR峰值都有差异，两个模型组没有差异。两个模型组的EAR面积、LAR持续时间、LAR面积也无明显差异。OVA 10 + Al(OH)3 100组连续出现EAR和LAR的动物数为整组6只。

Fig.2 The Penh runningaverage curve of normal control group

图2 正常对照组Penh移动平均曲线

Fig.3 The Penh runningaverage curve of OVA 10 + Al(OH)3 100 group

图3 OVA 10 + Al(OH)3 100组Penh移动平均曲线

Tab.3The count of EAR and LAR

表3 EAR和LAR反应次数统计

Tab.4The EAR and LAR of OVA 10 + Al(OH)3 100 and OVA 10 + Al(OH)3 gel 4 groups

表4 OVA 10 + Al(OH)3 100、OVA 10 + Al(OH)3 gel 4组EAR和LAR

3. 肺组织病理检测结果

如图4与正常对照组相比（图4C、D），OVA 10 + Al(OH)3 100组（图4A、B）显示血管充血，肺组织有灶性出血，肺泡间隔增宽，肺泡腔内有渗出，分泌物增多（箭头所示），且以嗜酸性粒细胞为主的炎细胞也增多，提示造模成功，符合哮喘时有以嗜酸性粒细胞浸润为主的炎症的特点。

Fig.4 The HE staining ofleft lung on day 38

图4 第38天左肺HE染色结果

本实验采用昆明种6-8周龄的健康成年小鼠，体重均在33±2g，SPF级。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京斯贝福生物科技股份有限公司，动物用水为实验室制UP水经过除菌处理。饲养及实验操作均于具有检验合格资质的SPF级屏障动物室内进行，并且实验动物以完整的包装直接进入屏障实验室，观察室适应7天后无异常情况，方可进行实验。所有实验中小鼠均引颈处死，尽量减少动物手术创伤程度及失血量。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

1. 该模型鉴定和评价的技术方法和指标体系，符合溃疡性结肠炎的病理特点，尤其与溃疡性结肠炎反复发作、迁延不愈的临床特点高度相似。

（1） 疾病活动指数

（2） 结肠指数

（3） 结肠组织大体评分

（4） HE 染色病理观察

（5） MPO 酶活性检测

2. 与国内外现有模型的异同

现有的溃疡性结肠炎的造模方法有单一化学法刺激、免疫法、免疫复合法、基因修饰法。虽然现在建造UC动物模型的方法多种多样，但是依旧存在着或多或少的缺陷。理想模型要简单易操作，同时尽可能全面、准确的模拟人类UC的病理生理学特点和表现，既要与自发的炎症诱因相近，又要符合肠道炎症进展、组织损伤进展等，同时模型病变尽量维持较长时间，能尽量反映慢性病变的过程和特点，以满足实验的需求。而目前尚缺乏能满足这些要求的模型，且已有模型以急性损伤模型为主。故亟待寻找更好的，具有良好重复性、稳定性，并且操作简单的动物模型，从而为研究UC发病机制、研发治疗新药物提供良好的基础。

3. 本研究的主要创新点或技术关键

3.1 创新点

本模型采用诱导剂联用的方法，建立慢性、炎症维持时间长且病程稳定的小鼠慢性 UC 造模方法。该模型改进了传统溃疡性结肠炎模型的病程短、稳定性差、模型指标缺少特异性等问题，更大程度的模拟了临床慢性溃疡性结肠炎病理指标。

3.2 关键技术

采用噁唑酮和2,4,6-三硝基苯磺酸两种诱导剂联用、致敏与感染相结合的方法，建立了新慢性、炎症维持时间长且病程稳定的小鼠慢性 UC 模型方法。

4. 可行性分析

4.1 前期摸索研究充分，通过阅读大量中外文献，较充分的了解溃疡性结肠炎疾病以及模型建立过程中的问题。

4.2 实验单位具备动物饲养许可证以及较先进的实验器材和检测设备。

4.3 通过阅读大量中外文献和走访调研，噁唑酮和三硝基苯磺酸在临床上应用广泛，效果明显，具有可行性。