偏侧黑质原位基因编辑帕金森猕猴模型

1实验动物和伦理

实验方案和动物福利均获得中国科学院昆明动物研究所伦理委员会的批准（IACUC No.15001）。猕猴单笼饲养，标准的明/暗周期，自由取食饮水并由兽医照看。10只雄性成年猕猴参与PD建模。其中，4只用于初步研究，尝试单独编辑PINK1（n=2，90067，95301）或DJ-1基因（n=2，95075，97081）；另4只用于PINK1与DJ-1基因的共同编辑（n=4，070229，070209，94089，97093）；其余2只猕猴是年龄匹配的对照（n=2，99357，91097），用于比较TH免疫组化染色结果。

2病毒载体构建和突变效率检测

AAV9-SaCas9载体从Addgene（＃61593）获得并在COS7细胞系进行突变检测。我们构建的sgRNA-PINK1-A、sgRNA-PINK1-B、sgRNA-DJ-1-A和sgRNA-DJ-1-B均在COS7细胞的PINK1与DJ-1蛋白编码区引起错义突变。

3 MRI指导的黑质（substantia nigra, SN）精准定位和病毒注射

猕猴脑黑质（SN）的准确定位（误差<1 mm）是实现AVV基因编辑有效性的先决条件，需要通过精准注射AVV成功转染大范围的SN。猕猴肌注阿托品（0.5 mg/mL，1ml，i.m.，Handu，中国新郑），10分钟后肌注氯胺酮（1.0-1.5 ml，0.1 g/2 ml，i.m.，中国台州中牟）麻醉猕猴，然后肌注戊巴比妥钠（40 mg/mL，20 mg/kg，i.m.，Fluka，德国）维持深度麻醉。

为了使AVV转染范围最大限度覆盖猕猴SN，我们添加了两个具有相同参数的注射平面，分别位于SN最大面积平面的前后，间隔2 mm。因此，SN注射共有三个平行的冠状平面。病毒注射共设6个点，每个注射点间隔1 mm（每条路径总剂量50 μL）。同一SN的相邻两条路径注射以相同的方式进行。三个平行注射路径共150 μL的病毒，猕猴的对侧黑质为对照，注射不含基因编辑元件的AAV。我们通过注射泵（World Precision Instruments，Inc.，UMP 3-4，USA）维持病毒注射速度为800 nL/min。之后，缝合伤口。猕猴每天肌注80万单位青霉素防止感染，持续一周。

4行为数据的收集和分析

1）我们通过数码相机（Sony HDR-XR260，日本）收集每只猕猴行为的录像。在上午10：00-11：00，位于笼子前方1米处的照相机在没有外部干扰的情况下记录单笼猕猴行为1小时。实验期共收集日常行为数据七次，分别在第0周（基线），术后第6、10、12、14、16和18周的每周三上午进行。

2）为了检测基因编辑对黑质-纹状体多巴胺功能的影响，我们采用Apo诱导的旋转进行评估。首先，在1小时的视频中，从第15分钟到第45分钟的30分钟内，对每只猕猴的自发旋转计数。其次，猕猴注射Apo 10分钟后，拍摄一段新的1小时视频。同样从第15分钟到第45分钟的30分钟进行旋转计数。在肌肉注射前5分钟，将2 mg的Apo溶解于2 mL（1 mg/mL）的维生素C溶液（0.5 mg/2 mL）。在第0周（基线）、术后第6周、第10周、第12周、第14周的每周三日常行为录像后分别进行5次旋转行为测试。

3）为了研究猕猴在PD发展过程中的精细运动障碍，我们进行了食物抓取测试。猕猴需要从笼子前面的食物盒内拿一块食物作为奖励。抓取行为稳定后，收集基线数据，记录抓取食物的潜伏期、正确率和利手偏好。每只猕猴须在每个测试周的三天内完成180次测试（每天60次）。猕猴分别于第0周（基线）、术后第6周、第10周、第12周、第14周测试五次。

5 PD病理特征染色

1）TH染色：猕猴双侧SN的冠状切片用3% H2O2（5 min）、3% triton X-100（4 min，中国北京索莱宝）和羊血清（15 min，中国福州迈新）处理，兔抗TH抗体（1:1000，AB152，Millipore）4 °C过夜。次日，将切片与二抗（PV-9000，30 min，中国北京中杉金桥）37 °C孵育。之后，切片DAB显色2 min（DAB-1031Kit，20×，中国福州迈新），苏木精复染细胞核。

2）PSer129αS染色：切片用10 μM/ mL蛋白酶K（中国上海阿拉丁）在10 mM Tris-HCl，pH=7.8、100 mM NaCl，0.1％Tween-20（Bio-Rad，美国）37°C处理30 min。之后切片用3％H2O2（5 min，中国福州迈新）、3％Triton X-100（4 min，中国北京索莱宝），10％羊血清处理（15 min，中国福州迈新），经典的兔抗PSer129αS多克隆抗体（1：100，ab59264，Abcam，美国）4°C过夜。次日切片与抗兔/小鼠二抗试剂盒（PV 9000，中国北京中杉金桥）37°C孵育30 min。之后，切片DAB显色2 min（DAB-1031Kit，20×，中国福州迈新），苏木精复染细胞核。

染色后，所有切片用乙醇梯度脱水并用二甲苯透明。中性树脂封片，光学显微镜（奥林匹斯，CX41；照相机：奥林匹斯DP25；软件：cellSens Entry 1.4.1；日本）采集照片。因大多数黑质多巴胺能神经元位于黑质致密部，我们在4×物镜（3.5 mm × 2.6 mm）、20×物镜（690.8 μm × 518.1 μm）和40×物镜（345.4 μm × 259 μm）下鉴定典型的细胞形态并以第三对脑神经3n为参考，选定黑质长轴近中心区域用于细胞计数。

通过ImageJ软件（National Institutes of Health，Bethesda，Maryland，USA）在40×物镜下对计数区域的黑质多巴胺能神经元（TH阳性染色细胞）计数，分别获得猕猴对照侧和基因编辑侧的平均细胞密度（个数/mm2），进行统计。

6基因编辑效果验证的共聚焦成像和数据量化

通过Nikon A1共聚焦显微镜获取z-stack图像。分析EGFP+NeuN+和EGFP-NeuN+黑质细胞的Paris的荧光强度用于定量PINK1的表达水平，以及分析EGFP+NeuN+和EGFP-NeuN+黑质细胞DJ-1的荧光强度，量化DJ-1的表达水平。

1基因编辑猕猴多巴胺能系统严重损伤并出现精细运动障碍

经典PD症状评估之后，我们进行了药理学验证，通过经典药理旋转范式评价PD相关的多巴胺功能缺陷。本实验中，猕猴进行阿扑吗啡（Apo，一种多巴胺D1受体激动剂）诱导的旋转测试。在受损侧纹状体的突触后多巴胺受体总是比健康侧的突触后多巴胺受体对Apo更敏感，这种不平衡将导致猕猴在接受Apo注射后转向健康侧。在病毒注射后，给予Apo之前，由于基因编辑对黑质多巴胺能系统的损伤，猕猴缓慢发展为向损伤侧旋转的趋势（图1 A）。给予Apo后，旋转方向转为健康侧（图1 B）。表明基因编辑后猕猴脑中PD相关的多巴胺系统严重损伤。

PD患者另一个行为异常是精细运动障碍。我们通过训练猕猴抓取食物进行测量。根据猕猴的利手偏好选择损伤黑质的哪一侧：1号中年猕猴和1号老年猕猴都是100%的右利手，所以我们将PINK1和DJ-1的AAV9s-sgRNA-Cas9注射到它们左侧黑质。相反，2号中年猕猴和2号老年猕猴基本都是左利手，我们对其右侧黑质进行基因编辑。病毒注射后，4只猕猴中3只在食物抓取中改变了利手（图1 C），它们无法使用以前的利手获取食物，不得不使用非利手。只有1号老年猕猴保持其手的偏好，但是，其取食的潜伏期显著增加（图1 D），准确度没有变化（图1 E），表明这只猕猴精细运动障碍较轻。

图1 阿扑吗啡（Apo）诱导的旋转测试和取食任务验证偏侧黑质基因编辑猕猴模型的多巴胺功能障碍和精细运动技能损伤。（A）基因编辑后，猕猴向损伤侧自发的旋转圈数逐渐增多。（B）基因编辑后，Apo诱导猕猴向健康侧旋转圈数逐渐增多。（C）1号老年猕猴除外，另外三只猕猴在注射病毒后改变了它们利手偏好。（D）基因编辑后，1号老年猕猴在取食任务中的潜伏期显著增加。（E）1号老年猕猴在取食任务中的准确率与基线相比没有显著变化。（A-B）和（D-E）的数据是平均值±SEM。

总之，通过AAV介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统共同编辑成年猕猴偏侧黑质的PINK1和DJ-1基因可导致PD典型的运动症状并得到药理学与精细运动能力测试验证。

2 黑质多巴胺能神经元的病理验证

首先需排除对照侧病毒注射对黑质多巴胺能神经元的影响。我们发现两只基因编辑猕猴对照侧的多巴胺能神经元与我们以前的研究中的两只年龄匹配的对照猕猴（没有任何手术的正常对照）相比，无论是细胞形态还是细胞数量都没有显著差异，表明AAV9注射剂和AAV9-SaCas9-SgControl不会对SNs造成任何明显的损伤。

其次，为了验证细胞计数方法的可靠性，对于SNpc中多巴胺能神经元的总数，我们采用Garcia等和Gundersen等使用的方法估算。结果表明，基因编辑猕猴对照侧SNpc神经元的平均总数约14800，与之前的报道一致（约14500），表明该计数方法是可靠的。黑质PSer129αS聚集计数时，发现阳性染色信号则进行统计。

3 病毒转染和基因编辑的结果验证

我们通过EGFP阳性神经元Paris水平来衡量PINK1/Parkin通路的功能。若PINK1功能缺失，其关键底物Paris/ZNF746的表达上升。结果显示，与EGFP阴性神经元相比，Paris/ZNF746的表达量在AAV9-CRISPR/Cas9基因编辑猕猴（2号中年猕猴）的SN区域显著增加（图2 AB）。不仅验证了AAV成功转染了神经元，还导致了PINK1/Parkin通路功能缺失，即Paris上调，与人类PD脑病理一致。同时，我们检测了DJ-1蛋白在EGFP阳性神经元中的表达，并与基因编辑侧SN附近的EGFP阴性神经元进行了比较，发现DJ-1显著下调（图2 CD）。综上，黑质AAV介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统导致PINK1和DJ-1功能下调，可能共同诱发猕猴PD发生。

图2 PINK1与DJ-1表达水平改变的免疫荧光图像与定量。（A）EGFP阴性或EGFP阳性神经元（NeuN+）中可见Paris（红色）荧光强度信号。（B）EGFP阳性神经元中Paris的荧光强度显著增加（EGFP阴性神经元：N=18；EGFP阳性神经元：N=30，P<0.001），是PINK1功能下调的可靠标志物，已在PD患者中得到证实。（C）EGFP阴性或阳性神经元（NeuN+）获得的DJ-1（红色）荧光强度信号。（D）EGFP阳性细胞中DJ-1的荧光强度显著降低（EGFP阴性神经元：N=24；EGFP阳性神经元：N=24，P<0.001）。比例尺：白色：100 μm，黄色：20 μm。B和D的数据是平均值±SEM。

4 基因编辑对猕猴黑质小胶质细胞和星型胶质细胞的影响

为了解析病毒注射引起胶质细胞激活引发的炎症是否导致PD发生，我们首先检测了黑质星形胶质细胞和小胶质细胞是否被黑质EGFP+区域的病毒转染与激活（图3 A）。与基因编辑的SN中EGFP-区域相比（图3 B），我们发现GFAP+细胞和Iba1+细胞都未与EGFP信号共表达，表明胶质细胞未被病毒转染。此外，胶质细胞没有明显的形态变化（图3 AB）。计数表明，与EGFP-区相比，SN中EGFP+区GFAP+和Iba1+细胞数量均无显著增加（图3 CD），表明AAV9介导的基因编辑过程中胶质细胞没有增生。

图3 基因编辑侧黑质胶质细胞的免疫荧光图像与定量。（A）基因编辑侧SN区域，EGFP+阳性神经元附近星形胶质细胞（GFAP+细胞）和小胶质细胞（Iba1+细胞）的免疫荧光染色图像。（B）基因编辑侧SN区域，未表达EGFP附近（对照），即EGFP-附近星形胶质细胞和小胶质细胞的免疫荧光染色图像。

（C）基因编辑侧SN区域，星形胶质细胞（GFAP+细胞）数量没有显著增加（P=0.687）。（D）基因编辑侧SN区域，小胶质细胞（Iba1+细胞）数量也未见显著增加（P=0.066）。比例尺：40 μm；C和D的数据是平均值±SEM。

动物模型制备过程中的监督管理、处置措施、微生物菌株检测、对环境和生态影响的评估等由中国科学院昆明动物研究所实验动物中心统一管理。建模过程中未见动物出现感染与毒性反应等。

用于构建模拟人类帕金森病患者PINK1与DJ-1基因功能缺失突变导致疾病发生的成年猕猴帕金森病模型，对于帕金森病的病因、发病机制以及诊断标志物发掘具有重要的参考价值。