SARS-CoV-2 滴鼻感染 K18-hACE2转基因小鼠模型

1、病原（细胞/基因/病原/其他造模因素）信息

SARS-CoV-2（原2019-nCoV, HB-01），由中国疾控中心谭文杰教授提供，新型冠状病毒的全基因组序列可以在GISAID (BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-01/2020|EPI_ISL_402119)获得，存放于中国微生物数据中心（登录号NMDC10013001，基因组登录号MDC60013002-01）。

2、实验动物背景信息

选择SPF级4-6周龄的K18-hACE2转基因雄性小鼠，18-20g，来自中国医学科学院医学实验动物研究所。

3、研究背景

近年来COVID-19病人的神经症状与神经相关后遗症备受关注，偶有尸检报道在死后COVID-19病人脑内检测到SARS-CoV-2的存在，而SARS-CoV-2的神经毒性也成为研究的热点。研究神经毒性、入脑途径及相关的防治措施，建立SARS-CoV-2入侵脑组织的动物模型是必不可少的环节。而前期建立的CAG-hACE2转基因小鼠、虎斑猫、恒河猴等COVID-19模型，并未出现明显的脑组织感染。因此，我们建立了K18-hACE2的转基因小鼠，该小鼠hACE2不仅在肺等呼吸系统内高表达，脑组织也显著表达hACE2。此模型为研究SARS-CoV-2的入脑途径、神经毒性与相关机制以及抑制神经损伤药物的研发和转化提供了工具。

1.Helms, J. et al. Neurologic features in severe SARS-CoV-2 infection. N. Engl. J. Med.382, 2268-2270 (2020).

2. Mao, L. et al. Neurologic manifestations of hospitalized patients with coronavirusdisease 2019 in Wuhan, China. JAMA Neurol. 77, 683-690 (2020).

3. Puelles, V. G. et al. Multiorgan and Renal Tropism of SARS-CoV-2. N. Engl. J. Med.383, 590-592 (2020).

4. Song, E. et al. Neuroinvasion of SARS-CoV-2 in human and mouse brain. J. Exp.Med. 218, e20202135 (2021).

1.实验材料

1.1 SARS-CoV-2 (BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-01/2020|EPI_ISL_ 402119)毒株由中国医学科学院医学实验动物研究所分离并保存。

1.2 实验动物

选择SPF级4-6周龄的K18-hACE2转基因雄性小鼠，18-20g。

2.实验环境

所有涉及的病毒实验操作全部在中国医学科学院医学实验动物研究所ABSL-3实验室完成，该实验室已经具备相关实验室和福利伦理资质。

3.病原培养鉴定

将新型冠状病毒接种到Vero细胞进行分离和储存。Vero细胞培养在DMEM（英潍捷基, 美国）添加10%胎牛血清，100 IU/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素的培养基中，环境为37°C，5%CO2。新型冠状病毒的病毒滴度用标准的半数细胞感染率（a standard 50% tissue culture infection dose，TCID50）进行分析。

4.实验操作规程

4.1 动物模型的感染方法

（1） 途径：滴鼻；

（2） 感染剂量：1×102TCID50 只；

（3） 感染体积：50μl/只；

（4） 对照组：等体积 PBS。

4.2动物模型分析

（1）症状观察：感染后，每天观察动物一般症状，记录体重，体温等。

（2）病毒载量：定期收集各组动物脏器（包括咽拭子），进行RNA抽提，利用RT-PCR技术，检测组织中病毒载量。RT-PCR所用的新型冠状病毒引物如下：上游为5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’ 下游为5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’。

（3）病毒分离：肺组织在 DMEM 溶液中研磨制备成匀浆，离心分离上清后，接种于Vero细胞分离病毒并观察细胞病变。

（4）病理学观察：用新鲜的组织福尔马林固定，制备石蜡切片，用HE，PAS等特染，免疫组化或荧光染色，镜下观察。

（5）免疫组化和荧光染色肺脏切片用PBS洗三遍，用固定液充分固定，用封闭液室温封闭 1h，一抗4°C 封闭过夜，PBS洗三遍，二抗37°C 孵育1 小时， PBS 洗三遍。用 DAPI 染细胞核观察新型冠状病毒在仓鼠肺脏等各脏器的分布。新型冠状病毒一抗为病人恢复期血清，羊源抗人二抗用， FITC 标记。

4.4数据统计处理方法

所有的数据用GraphPad Prism 8.0软件分析，感染组和照组用T 检验方法分析差异，显著性差异用*p﹤0.05, **p﹤0.01 或者 #p﹤0.05, ##p﹤0.01 表示。

4.5 动物伦理

实验动物涉及的内容符合实验动物伦理，并通过实验动物伦理审批 (QC20010)。

1、细胞/基因/病原/蛋白表达/免疫组化 鉴定、病原学检查信息

（1）鼠尾提取DNA后，经 PCR鉴定 K18-hACE2小鼠hACE2的表达（Figure 1）。

Figure 1. Identification of K18-hACE2 transgenic mice by PCR.

（2）各脏器病毒检测：感染后5dpi在肺、气管、脑、血清、淋巴结、心、脾、肠等各组织均可检测到SARS-CoV-2核酸的存在（Figure 2）。

Figure2.Viral RNA (log10 RNA copies/mL)by qRT-PCR assay detected in tissues of SARS-CoV-2-challengedK18-hACE2 transgenic miceat 5 dpi.

（3）原位杂交可检测到感染动物肺、脑和心脏等组织存在SARS-CoV-2 S RNA（Figure 3）。

Figure 3. SARS-CoV-2 S RNA detected in tissues of SARS-CoV-2-challenged K18-hACE2 transgenic mice at 5 dpi byin situ hybridization. (A) Lung, (B) brain and (C) heart.

2、表型分析（包括生理生化、解剖学、生物学特征等）

感染5dpi后大体解剖未见各脏器的明显病变。

3、影像/行为/临床/病理表型

（1）大体观察：临床症状观察包括动物的体重变化，一般症状观察（弓背、竖毛、反应度降低等）等。与部分患者相似，动物感染后主要表现为体重轻微下降（Figure 4）。

Figure 4. Body weight changes in K18-hACE2 transgenic miceafter viral infection at 5 dpi.

（2）病理学检测发现，被感染动物的肺组织出现间质性肺炎，呈轻到中度间质性肺炎改变，可见炎细胞浸润，血管周围炎细胞浸润，肺泡腔内可见巨噬细胞及渗出，在间质性肺炎和巨噬细胞浸润方面与临床一致。另外，原位杂交结果显示SARS-CoV-2 广泛分布于K18-hACE2小鼠脑内，主要涉及脑区有嗅球、大脑皮质III-V层、下丘脑、中脑和脑干。并可引起明显的神经细胞变性、坏死。脑血管周围炎细胞浸润和胶质细胞增生等（Figure 5, Figure 6）。

Figure 5.Histopathological changes of of SARS-CoV-2-challenged K18-hACE2 transgenic mice at 5 dpi. (A) Normal histological images of mock-treated group by H&E staining. (B)Histopathological observations indicated that interstitial pneumonia with thickened alveolar septa (black arrows) and infiltration of lymphocytesin model mice. (C) Distribution of SARS-CoV-2 spike protein (S) in SARS-CoV-2-challenged K18-hACE2 mice detected by fluorescence in situ hybridization (FISH). (D) Representative images of H&E-stained neurons showing denatured and necrotic cells in the cortex layer IV of infected K18-hACE2 mice. (E) H&E-stained image showing vasculitis in the brain of infected K18-hACE2 mice.

Figure 6. Activation of glial cells in SARS-CoV-2-infected animal models. (A) Representative images showing IHC staining for Iba1, a marker for microglia in the cortex of infected K18-hACE2 mice. (B) Representative images showing IHC staining for GFAP, a marker for activated astrocytes in the cortex and hippocampus of infected mice.

微生物菌株管理、使用，vero细胞系的使用和动物模型制备过程中遵循动物福利和各项管理制度，动物无逃逸。所有涉及的病毒实验操作全部在中国医学科学院医学实验动物研究所ABSL-3实验室完成。

模型制备完成后福尔马林固定，在蛋白核酸等成分固定后进行病理染色分析，对环境和生态并未产生明显影响。

1. 动物模型评价方法和指标体系

本实验建立的新型冠状病毒小鼠模型采用监测临床症状、病毒学、病理学等方法进行分析和鉴定，确定该动物模型成功建立 。

（1）大体观察：感染后每天监测体温，记录一般症状、体重等。动物感染后1-4天出现体重轻微下降。攻毒剂量增加时，可出现动物的死亡，可模拟部分病人的临床症状。

（2）病毒学监测发现，RT-PCR和原位杂交可在肺、脑、血清、脾、淋巴结、肾、胃肠等也检测到病毒存在。在病因学上模拟COVID-19的发生。

（3）病理学检测发现，被感染动物的肺组织出现间质性肺炎，可见炎细胞浸润，血管周围炎细胞浸润，肺泡腔内可见巨噬细胞及渗出。脑组织也出现胶质细胞增生、脑血管炎和神经细胞的变性坏死。在间质性肺炎和血管炎等方面与临床一致。

综上我们制备的模型模拟了部分轻型、普通型和重型感染病人的主要指标，模型构建成功。

2.与其他新冠肺炎的小鼠、猫与仓鼠等模型相比，K18-hACE2模型的肺组织表现为轻到中度度间质性肺炎。比较特异性的表现为其脑组织和血清中可检测到大量病毒的存在。

3.该模型为研究病毒的肺外组织损伤、神经毒性、入脑途径、病毒血症及相关的防治措施提供了良好的工具。