SARS-CoV PUMC01感染大鼠模型

2002年在中国广东爆发的严重急性呼吸综合征（SevereAcute Respiratory Syndrome，SARS）波及全世界34个国家。2003年4月16日，世界卫生组织根据包括中国内地和香港地区，加拿大、美国在内的11个国家和地区的13个实验室通力合作研究的结果，宣布重症急性呼吸综合征的病因是一种新型的冠状病毒，称为SARS冠状病毒。

SARS早期(1~3d），不断释放到血液中SARS-CoV，引起病毒血症。临床上，表现为发热、畏寒、头痛、肌痛等症状。从SARS疾病的起始，淋巴细胞就受到了SARS-CoV的侵袭，因此，患者的外周血淋巴细胞数目减少是诊断SARS的重要指标。SARS轻症患外周血CD3+、CD4+、 CD8+数恢复正常；重症患者呈持续下降。所有死亡SARS患者尸解标本中，脾、淋巴结、扁桃体和肠道的淋巴组织萎缩，淋巴细胞大量减少，呈现出耗竭状态。在数周到2个月时间内，SARS-CoV对重症SARS患者免疫器官的损伤程度达到了艾滋病晚期水平。由于患者发生免疫缺陷，因此，发生机会性感染的发病率在本组病例中高达50%。

陷窝蛋白-1在呼吸道上皮细胞内高表达，SARS-CoV感染造成多组织脏器损伤，以肺损伤最突出。初始在肺组织中复制增值的SARS-CoV、经血重新进入肺的SARS-CoV和渗出到肺组织中的淋巴细胞、单核细胞本身携带的SARS-CoV在肺内聚积、增殖，不断加重肺损伤。这种损伤具有连续性、弥漫性、严重性的特点，导致广泛性肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤，大量蛋白性液体、纤维蛋白、炎症细胞渗出和炎症介质的过量释放，造成了肺内毛细血管的通透性显著增加，最后引起弥漫性肺泡损伤（diffuse alveolardamage, DAD）发生。此时，疾病陷入进展期（4~9d）。在进展期，与肺部的病理改变相对应，患者出现咳嗽、气促、胸闷和呼吸困难等呼吸系统症状。X线检查，肺内早期病变是两肺下野出现斑片状阴影。病情继续发展，到达极期（10~14d），患者出现严重呼吸困难，甚至发生急性呼吸窘迫综合征。X线下，进展期和极期病变迅速发展为两肺广泛病变，呈现弥漫分布斑片状渗出阴影，伴有磨玻璃阴影、边界模糊结节状实变影。

大鼠包括SPF级Wistar大鼠、SPF级SD大鼠和SPF级Lewis大鼠。

SARS-CoV病毒株为PUMC01（Sino-1, GenBank Acc. #; AY350750），分离自一个死于北京协和医院的典型的SARS患者（PUMCH）。SARS-CoVPUMC01病毒通过鼻腔喷雾方法感染动物。Wistar大鼠、SD大鼠和Lewis大鼠三个品系的动物，每个品系分成4周龄和7周龄两个年龄组，每个年龄组又根据感染病毒剂量的不同，分为高剂量组和低剂量组。动物安乐死后，取肺、脾、肝、肠淋巴结和血液样品进行病毒拷贝数和病毒滴度检测。感染后第7、14、21、28天检测SARS-CoV的IgG抗体动物安乐死后，取肺、肝、脾、肾和肠淋巴结组织进行病理检查。

1. 大鼠感染后病毒在组织中复制情况

三个品系的大鼠分别在感染后第3，6，9，12、15、21和28天被处死，取肺、肝、脾、肾、血、肠系膜淋巴结，用病毒分离和RT-PCR方法检测病毒复制情况。Wistar和SD大鼠未检测到病毒。在感染Lewis大鼠的肺、肝、血中可以分离到病毒，以RT-PCR病毒检测结果判定，Lewis大鼠在感染后的12天之内，感染的24只大鼠均为阳性，感染率为100%，见表1。对照组病毒分离和RT-PCR的结果均为阴性。

表1 SARS-CoV3个品系大鼠中复制

2. 大鼠感染后血清中SARS-CoVIgG抗体水平

在感染后第7，14，21和28天检测抗SARS-CoV IgG抗体。在Wistar和SD大鼠中，在感染后第7天可以检测到抗SARS-CoVIgG抗体，在感染后第15-21天达到顶峰，在第28天后滴度开始下降。Lewis大鼠的抗SARS-CoV IgG抗体在感染后第28天仍然保持较高的滴度。4-7周龄Lewis大鼠抗体滴度随时间的变化见图2。对照组抗未检测到抗SARS-CoV IgG抗体。

图2测定被感染Lewis大鼠血清SARS-CoVIgGOD值

3. 大鼠感染后临床病理变化

实验组Lewis大鼠在感染SARS-CoV后出现嗜睡、食欲下降、体重减轻、毛发粗乱等临床症状。在Wistar和SD大鼠感染后第3，6，9，12、15、21和28天取肺、脾、肝等组织做病理学检查，未见明显的病理改变。在Lewis大鼠中，脾和肝脏未见明显的病理改变，在肺脏组织中可见明显的肺炎改变。感染Lewis大鼠第3天肺组织呈局限性间质性肺炎改变，表现为局部肺组织间隔增宽，血管充血伴多量以单核细胞和淋巴细胞为主的炎细胞浸润，肺泡腔内可见渗出物，肺泡上皮有坏死和脱落。感染第6～9天肺组织间隔明显增宽、融和伴多量炎细胞浸润，肺泡内可见明显的纤维素样渗出及出血，其中还可见较多的泡沫样组织细胞，有的小支气管、小血管周围可见多量炎细胞浸润，支气管腔内可见炎性渗出物，部分支气管上皮损伤脱落。感染第15天肺组织病变区域缩小，增厚的肺间隔内有多量泡沫样组织细胞浸润，未见出血及渗出。感染第21～28天肺组织病变区明显缩小，仅见少许淋巴细胞浸润，肺泡内渗出物消失，纤维结缔组织增生。肝脏及其它脏器未见明显病理变化。对照组动物各脏器未见明显的病理改变，见图2。

免疫组化染色的方法显示在感染后第3天和第12天的肺组织中可以检测到SARS-CoV抗原表达，对照组免疫组化结果阴性，见图3。

图2 Lewis大鼠肺组织病理变化。(A)正常对照(HE, 100×)；（B）肺组织间隔增宽伴单核细胞和淋巴细胞浸润(HE, 100×)；（C）和（D）间隔明显增宽，肺泡内可见泡沫样组织细胞(箭头所指) (HE, 100×和 400×).；（E）部分支气管上皮损伤脱落 (HE, 100×)；（F）肺泡内可见明显的纤维素样渗出及出血 (HE, 200×)；（G） 肺泡纤维化和增生 (HE, 200×)。

图3 Lewis大鼠肺组织免疫组织化学染色。（A）正常对照(100×); （B）大鼠感染后3天肺组织(200×) ；（C）大鼠感染后12天肺组织(200×)。

Wistar大鼠和SD大鼠的病毒复制和病理学改变也不明显，提示这些动物也不适合作SARS动物模型。Lewis大鼠对SARS-CoV敏感，有明显的病毒复制、特异性抗体产生和病理学改变。

尽管大鼠不是SARS-CoV的自然宿主，但Lewis大鼠在感染SARS-CoV后出现临床症状，包括嗜睡、食欲下降、体重减轻、毛发粗乱。肺组织病理学检查可见间质性肺炎改变。在感染后第3－12天可以在肺、肝和血中检测到病毒的复制，在感染后第7天左右产生抗体，并至少可持续4周。肺组织出现病理改变的时间基本上与抗体出现时间一致。SARS-CoV感染Lewis大鼠后出现临床症状和拟人SARS的病理改变，提示它可能是比猫、小鼠[23]、雪貂这些对SARS-CoV敏感的小动物更好的替代模型。Roberts et al报道了SARS-CoV感染金黄地鼠的情况，在感染的动物呼吸道发现了感染相关改变，但是肺组织没有出现明显的病理改变和SARS特异性IgG抗体。

Lewis大鼠对SARS-CoV比其它的小动物更敏感，以RT-PCR病毒检测结果判定，Lewis大鼠在感染后的12天之内，感染率为100%。Lewis大鼠作为研究SARS-CoV感染机制的模型, 具有比食蟹猴和恒河猴经济, 方便和易于操作的优点, 比小鼠[23]载毒时间长, 病理改变更明显。它可以作为继食蟹猴和恒河猴之后的SARS小动物模型。Lewis大鼠作为SARS小动物模型国际上没有相关报道,是我们首创的。