肿瘤微环境互作小鼠肿瘤转移模型

转移是恶性肿瘤的关键特征之一，其发生不可避免及转移灶难以治愈的特点是导致90%以上癌症患者死亡的主要原因[1]。现有治疗方法主要采用手术切除、化疗和放疗，但均存在着毒副作用强、易复发等局限性[2]。且在实验研究中，目前的动物实验模型无法有效真实模拟肿瘤转移及临床治疗过程，故亟需一特异性模拟肿瘤发生、转移、定植全链条，符合当前抗肿瘤转移药物治疗基本流程规范的动物模型，更直接、可信的评价抗肿瘤转移药物治疗效果。

1. 肿瘤与微环境二元整合互作是肿瘤转移调控的功能单元和机制基础。

早在1889，英国医生Stephen Paget针对转移过程提出了“种子-土壤”假说，把恶性肿瘤比作种子，通过血液循环或淋巴道转移到远端，寻找到适合其生长的环境，即所谓的“土壤”，形成转移灶，进而发展为继发性肿瘤[3]。近年来，人们发现转移前的肿瘤“土壤”因素可以通过增强“种子”的转移特性及侵袭能力等，促进转移的发生[4]。而这种由肿瘤细胞和“土壤”中多种间质细胞、细胞因子、趋化因子等相互作用后形成的利于肿瘤生存的特殊环境，称为肿瘤微环境（tumormicroenvironment, TME）。TME主要由成纤维细胞和肌成纤维细胞、神经内分泌细胞、免疫和炎症细胞、血管和淋巴管系统以及细胞外基质组成，在转移发生时中各司其职、相互影响，直接或间接促进转移进程[5]。例如，肿瘤内的血管系统表现出结构和功能特性的改变，导致缺氧和营养供应有限，从而改变肿瘤细胞的基因表达，提高细胞的存活和对凋亡诱导的抵抗[6]。TME在转移研究中受到越来越广泛地关注，其不仅在转移全过程中发挥着关键作用，更影响着临床治疗效果，在抗肿瘤转移中不可忽视，可作为一具强吸引力的治疗靶向，降低肿瘤耐药性及复发风险。

1.2乳腺癌肿瘤微环境调节是肿瘤治疗的未来的重点领域和关键靶点。

乳腺癌（breastcancer, BC）是女性最常见的癌症，也是全世界女性癌症患者死亡的主要病症，其高转移性、高侵袭性、高复发率的特性对广大女性健康和生命安全造成极大威胁[7]。随着治疗观点及方法的不断进步，诸多研究认为，乳腺癌的发生并非乳腺肿瘤细胞单方面的作用，而是乳腺癌与其所处的TME相互作用引起的[7]。

在分析TME与乳腺癌细胞互作对转移的影响中，研究人员多聚焦于脂肪细胞、成纤维细胞以及免疫炎症细胞三个方面：（1）肿瘤相关脂肪细胞是乳腺组织中占比最大的细胞，表现为恶性表型，其脂质含量及晚期脂肪细胞分化标志物减少，并过表达炎症因子与蛋白酶，通过释放多种脂肪因子，如瘦素、脂联素、白细胞介素、趋化因子配体2等，促进BC的增殖、血管生成、扩散、侵袭和转移；（2）肿瘤相关成纤维细胞是TME中最大的基质细胞群，其可通过影响雌二醇水平，分泌多种因子和基质金属蛋白酶（matrix metallo-proteinase, MMPs），诱导干细胞、表观遗传改变等促进肿瘤的发生和发展，还可通过增加MMP14的表达和MMP9的活性，诱导原位癌上皮细胞在体内外的侵袭能力[8]。（3）肿瘤相关免疫炎症细胞会阻碍药物进入肿瘤细胞内发挥药效，例如巨噬细胞可重塑基质，产生的MMPs、半胱氨酸组织蛋白酶和丝氨酸蛋白酶，允许细胞外基质（extracellular matrix, ECM）破坏以及随后的肿瘤细胞侵入周围组织，从而引导肿瘤细胞转移[9]。

目前的治疗方法除集中于提高对肿瘤细胞的杀伤能力，也逐渐的靶向TME中的基质细胞。TME作为乳腺癌细胞赖以生存的“土壤”，在肿瘤的发生发展中起到重要作用，且基质细胞的基因组稳定性使其成为新型抗癌治疗剂的理想靶标，发生治疗耐药性的风险降低，使得TME基质细胞靶向治疗成为未来有潜力的抗乳腺癌治疗方法。

1.3乳腺癌微环境包括原位肿瘤微环境与血液微环境两部分，是肿瘤转移的重要决定要素，也是中药抗肿瘤转移有效性评价和科学性阐释的核心领域。

1.3.1乳腺癌原位肿瘤的特征性描述

在乳腺原位癌TME中，肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages，TAM)是最丰富的免疫细胞群，可促进肿瘤发生、新血管生成、免疫抑制TME重塑、癌症化疗抵抗、复发和转移。TAMs可分为M1型和M2型，M1型TAMs通过表达趋化因子CCL20、趋化因子生长调节基因(C－X－C motif ligand，CXCL)10和CXCL11以及分泌干扰素和白细胞介素12募集、激活自然杀伤细胞和树突状细胞；此外，M1型TAMs通过分泌趋化因子CCL15等诱导激活 T 细胞，具有抗肿瘤作用。M2型TAMs表达趋化因子CCL17等能增加VEGF、IL－8、MMP、转化生长因子和T细胞抑制分子的分泌，促进血管生成和细胞外基质重塑信号的表达，具有致瘤作用[7]。

由此可见，在乳腺癌原位瘤中，靶向TAM并介导其表型表达，可以有效影响肿瘤细胞转移。已有研究发现颗粒前体蛋白联合TAM衍生的外显体能够抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移。为此，乳腺癌原位TME在治疗乳腺癌转移及评价药物抗转移疗效实验中不可或缺。

1.3.2乳腺癌血行转移的特征性描述

肿瘤细胞通过血液循环向远处扩散是乳腺癌患者转移和复发的重要途径，即血行转移。原位癌细胞增殖过程中，肿瘤性血管生长，侵袭基底膜、穿入血管后在循环系统中存活，形成瘤栓并运行到靶器官，滞留于靶器官的微小血管中，然后穿出血管形成微小转移灶。

癌细胞血行转移成功的关键是其在血流中能否存活，因为大部分血流中癌细胞将被剪切力和免疫系统攻击破坏，少于0.01%的癌细胞能够转移成功。目前的证据表明，在多种恶性肿瘤中都存在血小板数量增加和血小板活化现象，且这两者变化与癌症病情进展密切相关。肿瘤细胞自原发位置的脱落，诱导的血小板聚集在肿瘤细胞周围，保护肿瘤细胞在循环中免于破坏、利于肿瘤细胞与血管内皮细胞的黏附及移出血管，保证肿瘤细胞在血管内可以存活[10]。且肿瘤血行转移在癌症发生早期便已存在，因此及时、有效地发现和干预循环肿瘤细胞的产生、阻断血行转移是减少乳腺癌远处转移、提高患者生存率和生存质量的关键。但在动物实验过程中，单纯向静脉注射的肿瘤细胞模拟肿瘤血行并不能等同于肿瘤转移细胞，其存在的差别会造成实验结果可信度存疑。在抗肿瘤转移相关动物模型中必须对此进行考虑。

1.3.3中医药调节乳腺癌肿瘤微环境

肿瘤微环境中细胞与分子不断相互作用的现象，与中医学“阴阳失衡”的理论存在共通之处：机体阴阳消长失去相对平衡，气血、经络、脏腑等相互关系失调，则疾病发生发展。从中医角度认识肿瘤微环境，并利用中医药多成分、多效应的特点，干预调控乳腺癌肿瘤微环境，可为乳腺癌的治疗提供新的思路。

脏腑亏虚、正气不足为乳腺癌发病之本。从扶正固本入手，提高机体免疫功能、改善乳腺癌肿瘤微环境，可以发挥抗肿瘤作用。常用药物如人参、白术、黄芪、灵 芝、党参、当归、白芍、淫羊藿等。细胞实验及动物实验均表明，人参皂苷 Rg3 可诱导巨噬细胞向M1极化，改善肿瘤微环境[11]。黄芪多糖与巨噬细胞在一个体外培养体系中共存，能够显著抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移。

此外，瘀血阻于乳络发为乳腺癌，故活血化瘀是治疗乳腺癌的法则之一。活血化瘀类中药如丹参、郁金、姜黄、莪术、鸡血藤、川芎、三七等均为治疗乳腺癌的常用药物，主要机制是对肿瘤细胞的抑制、减少骨髓来源的抑制性细胞数量、抗肿瘤血管生成等[7]。对此，有必要充分发挥中医药的优势，从辨证论治的角度深入研究中医药在乳腺癌肿瘤微环境中的作用机制，并结合现代医学治疗方法，提高其在实际治疗中的应用，使乳腺癌患者受益。

1.4 现有模型及不足

1.4.1现有原位肿瘤移植模型以皮下种植为主，以腋窝或腹股沟为主要部位，缺乏微环境特异性模拟，更缺乏临床肿瘤治疗原位手术结合术后化疗的流程模拟。

1.4.2现有转移路径模型以尾静脉单独注射为主，虽能有效构建肿瘤入血后的转移活性评价，但仅限于对肿瘤细胞转移强度或位点的粗略分析，与肿瘤微环境组分的互作评价及肿瘤血液免疫微环境对循环系统肿瘤细胞的检测模型和评价认为空白。本模型有效构建，能够为活血化瘀中药基于肿瘤血液微环境调节实现肿瘤转移治疗应用的药效评价和机理解析提供有效的模型支撑。

1.5总结

基于上述分析和目前相关技术研究体系的不足，本规范拟强调肿瘤与微环境之间存在相互作用关系，在肿瘤转移中重视原位肿瘤细胞与巨噬细胞、循环肿瘤细胞与血小板对肿瘤转移全过程产生的重要影响，全方位真实模拟肿瘤的发生、转移及临床抗肿瘤治疗流程，提高抗肿瘤转移药物的药效评价可信度。

参考文献：

[1]Lin Z, Luo G, Du W, Kong T, Liu C, Liu Z. Recent Advances in Microfluidic Platforms Applied in Cancer Metastasis: Circulating Tumor Cells' (CTCs) Isolation and Tumor-On-A-Chip. Small. 2020;16(9):e1903899. doi:10.1002/smll.201903899

[2]史安可,陈永.天然多糖抗肿瘤转移作用机制研究进展[J/OL].天然产物研究与开:1-13[2022-07-19].

[3]Paget S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer Metastasis Rev. 1989;8(2):98-101..

[4]Liu Q, Zhang H, Jiang X, Qian C, Liu Z, Luo D. Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to "seed and soil" hypothesis. Mol Cancer. 2017;16(1):176. Published 2017 Dec 2. doi:10.1186/s12943-017-0742-4

[5]施经斌,熊阳.肿瘤微环境与乳腺癌细胞互作导致肿瘤转移的研究进展[J].中国临床药理学与治疗学,2022,27(05):562-574

[6]Xiao Y, Yu D. Tumor microenvironment as a therapeutic target in cancer. Pharmacol Ther. 2021;221:107753. doi:10.1016/j.pharmthera.2020.107753

[7]陈玉洁,孔祥定,陈静,董晓阁,杨艳林,王宽宇.中医药干预乳腺癌肿瘤微环境的研究进展[J].河南中医,2021,41(09):1442-1446.

[8]Mao Y, Keller ET, Garfield DH, Shen K, Wang J. Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer. Cancer Metastasis Rev. 2013;32(1-2):303-315. doi:10.1007/s10555-012-9415-3

[9]Joyce JA, Pollard JW. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 2009;9(4):239-252. doi:10.1038/nrc2618

[10]孙彬,李健,丛玉隆.血小板在恶性肿瘤转移中的机制[J].军医进修学院学报,2011,32(08):871-873.

[11]江昌. 人参皂苷Rg3对TME巨噬细胞极化的调控研究[D]. 中国人民解放军海军军医大学,2018.

2.1 小鼠乳腺癌原位肿瘤模型建立及术后干预

对小鼠高侵袭力乳腺癌进行体外培养和扩增，并将细胞状态和增殖水平调整至最佳水平。在此基础上，收获肿瘤细胞，并对细胞进行准确计数，按照1*104/100ul的细胞浓度将细胞在无菌生理盐水中稀释成单细胞悬液，置于冰上备用。

在小鼠的准备上，本实验选用在SPF级饲养环境中饲养的Bab/c小鼠，雌性、周龄6—8周。在接种肿瘤正式实验前，小鼠进行了3天的适应性饲养，并在肿瘤接种前一天进行腹部去毛备皮，充分暴露小鼠第四对脂肪垫的皮肤，利于肿瘤接种。

在肿瘤接种时，将备好的细胞悬液接种于小鼠乳房的第四对脂肪垫中，并在接种时注意接种部位和接种深度的选择。针头不能穿过脂肪垫进入腹腔中，也不能插入过浅，接种于皮下，同时还需注意进针位置和角度，防止肿瘤溶液溢出，从而影响肿瘤接种的数量差异。

在小鼠准确接种肿瘤细胞后，对小鼠持续饲养5-7天，待原位肿瘤明确形成并得到初步增殖扩大后，开始对各组小鼠进行随机分组给药。给药途径选取为腹腔注射给药，给药体积为200ul，各给药组设定为药物溶剂注射阴性对照组（NC）、0.1mg/kg（ESC-L）和1mg/kg（ESC-H）组。每日给药一次，并定期观测记录小鼠体重、原位肿瘤的生长状态和瘤体积。

在小鼠日常给药30—40天后，当原位肿瘤的瘤体积生长达到相应水平后，将小鼠的原位肿瘤进行切除。手术时，选用戊巴比妥（40mg/kg）注射和异氟烷吸入混合麻醉，从而保证了麻醉深度和麻醉安全性。在手术移除原位肿瘤时，需注意将原位肿瘤尽可能切除干净，从而有效避免肿瘤复发和原发部位肿瘤对后续转移进程的实验干扰。在原位肿瘤术后，在饲养水中加入庆大霉素，并对术后小鼠每日进行腹腔局部消毒。以保证小鼠顺利度过手术感染期。

在小鼠术后感染期度过后（约3-5天），继续对小鼠开始药物干预。并于药物干预持续20天后，作为实验终点。处死小鼠，获得各重要器官脏器，检测其病理性变化，并着重对乳腺癌主要转移靶器官（骨、肝、脑、肺）的转移水平进行评价和拍照，并保存标本，用于后续的组织、细胞和分子水平检测。

图1 乳腺癌转移体内药效学评价平台及基本实验流程简介。上图：荷瘤小鼠体内成像实验的基本流程示意图。下图：小鼠原味肿瘤接种的位置示意图及分组情况说明。

图2 4T1-LUC小鼠原位肿瘤生长的活性动态检测。图中分别展示了小鼠随机分组给药第一天(A)、第五天(B)、第十天(C)、第二十天(D)和第二十五天(E)的原位肿瘤成像结果。

图3.4T1-LUC荷瘤小鼠转移进程的活性。图中分别显示了原位肿瘤切除当天(A)、术后持续化疗10天(B)和20天(C)的小动物成像结果。

2.2 T-P体内复合物及NK细胞检测

抽取小鼠外周血，对血小板糖蛋白IIIa(CD61)和MHCI类进行荧光染色，观察其荧光染色情况以确定肿瘤细胞与血小板之间存在相互作用；应用流式细胞仪分析CEA及血小板标记物CD41a，以确定循环肿瘤细胞在体内被血小板包覆；应用流式细胞仪检测外周血NK细胞标记物CD56以确定其数量；应用LDH法及WST-8试剂盒验证NK细胞杀伤活性。

（1）4T1乳腺原位肿瘤移植模型构建

将Luc标记的小鼠乳腺癌细胞4T1细胞经皮下接种至BALB/C小鼠，用活体荧光成像系统连续观察，发现肿瘤面积显著增大，小鼠可存活45天以上，能够观察到明显的肺转移及其它脏器的转移。

（2）4T1肿瘤手术切除及术后转移成像

在原位肿瘤手术摘除后当天，小鼠荧光成像结果表明：（1）小鼠原位肿瘤的影像完全消失，证明原位肿瘤手术摘除完全，不存在原位肿瘤的残留，从而避免了术后残留对肿瘤转移进展的干预和影响；（2）小鼠中均出现了数量较多、成像明确、以肺转移为主的乳腺癌转移的阳性影像，从而证明，我们构建的乳腺癌体内转移模型有效、可信。

（3）4T1血行转移及T-P互作评价：

免疫荧光染色后可以观察到明显的血小板CD61（红色）和MHCI类（黄色）呈阳性；流式细胞仪下CEA阳性表达者为循环肿瘤细胞，同时可共同表达血小板标记物CD41a者则表明循环肿瘤细胞在体内被血小板包覆；NK细胞在肿瘤细胞与血小板互作的条件下，其数量及杀伤活性低于正常血液NK细胞。

（1）4T1乳腺原位肿瘤移植模型构建

将Luc标记的小鼠乳腺癌细胞4T1细胞经皮下接种至BALB/C小鼠，用活体荧光成像系统连续观察，发现肿瘤面积显著增大，小鼠可存活45天以上，能够观察到明显的肺转移及其它脏器的转移。

（2）4T1肿瘤手术切除及术后转移成像

在原位肿瘤手术摘除后当天，小鼠荧光成像结果表明：（1）小鼠原位肿瘤的影像完全消失，证明原位肿瘤手术摘除完全，不存在原位肿瘤的残留，从而避免了术后残留对肿瘤转移进展的干预和影响；（2）小鼠中均出现了数量较多、成像明确、以肺转移为主的乳腺癌转移的阳性影像，从而证明，我们构建的乳腺癌体内转移模型有效、可信。

（3）4T1血行转移及T-P互作评价：

免疫荧光染色后可以观察到明显的血小板CD61（红色）和MHCI类（黄色）呈阳性；流式细胞仪下CEA阳性表达者为循环肿瘤细胞，同时可共同表达血小板标记物CD41a者则表明循环肿瘤细胞在体内被血小板包覆；NK细胞在肿瘤细胞与血小板互作的条件下，其数量及杀伤活性低于正常血液NK细胞。

1 技术难点

（1）小鼠乳腺癌原位接种：在接种过程中难以把控是否接种在乳房垫而不是皮下，否则建模失败。

（2）小鼠体内血行转移过程中，肿瘤细胞与血小板形成的复合物难以富集，导致观察受碍。

2 创新性

（1）模拟肿瘤生长及转移全过程，考虑肿瘤微环境对肿瘤细胞转移产生的重要影响。

（2）模拟抗肿瘤转移的常规治疗方法，更直接的评价抗肿瘤转移药物的药效。

（3）检测体内肿瘤细胞-血小板聚集体，使检测结果更加直观、可靠。