雨蛙肽诱导急性胰腺炎小鼠模型

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是胰腺通过各种机制产生的消化性酶和应激信号之间存在不平衡时，导致的胰腺自身消化及周围组织炎症反应。AP的初始症状包括持续性和复发性腹痛，以及发热伴急性炎症反应，分为急性轻型胰腺炎和急性重型胰腺炎[1]。急性胰腺炎始于轻度不适，导致严重的器官功能障碍慢性发作，有时会出现急性重型胰腺炎，其死亡率高达20%-30%，其治疗主要是应用抑制炎性反应的药物，来降低其死亡率[2]。急性重型胰腺炎时极易出现多器官功能衰竭，包括呼吸系统和心血管衰竭[3]。

AP早期的病理改变为胰腺外分泌细胞的破坏，各种炎症细胞和炎症因子广泛产生，导致炎症瀑布级联反应的发生，其机制尚未完全阐明。胰腺外分泌腺泡细胞在消化酶的产生，分泌和调节中发挥指挥作用。由胰腺外分泌细胞分泌的酶原，在十二指肠中被激活，这些强力的消化酶有助于消化脂肪、蛋白质和碳水化合物[4]。胰腺炎的严重程度取决于活化的炎症介质的数量，白细胞介素-6(IL-6)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，活化B细胞核因子κ-轻链增强子(NF-κB)，半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)，p53，趋化因子和细胞因子[5]。胰腺炎也由胰腺中丝裂原活化蛋白(MAP)激酶途径和线粒体膜转换孔开放的激活报道[6]。

1.C57BL/6J 小鼠，名称：CBL|6J，近交系（Inbred Rat）

品系来源 ：1921年 C.C.Little用 Lathrop小鼠作近亲培育时，用No7雄鼠和No.52雌鼠交配，培育成C57。在C57中将毛色呈黑色的进行固定，培育成C57BL。1937年Ltle将维持的C57BL第六组亚系定名为C57BL6，将第十组亚系定名为C57BL10，继而分别维持至今。1947年从 Little引入到美国 Jackson Lab，形成C57BL/6J:1951年从 Jackson Lab将第32代引入到NH，形成c57BL6N亚系；1974年 Charles River从NH引入并于1975年进行了剖腹产。六十年代从 Jackson Lab引入到日本实验动物中央研究所,1986年自日本实验动物中央研究所引入到中科院上海实验动物中心。2001年中国北京维通利华从美国 Charles River引入第59代核心群。

2.雨蛙肽诱导对照小鼠模型C57BL/6J 小鼠，名称：C57BL/6J 小鼠

同类系（Consomic Rat）

3.诱导方法：小鼠年龄6-8w，雨蛙肽每隔一小时分7次腹腔注射，每次剂量为50ug/kg(溶于200ul，0.9%生理盐水中)，24h后处死动物。取血清检测淀粉酶、炎症因子等表达水平，胰腺组织行组织病理学检测。

1. 胰腺病理切片

C57BL/6J小鼠，每小时腹腔注射雨蛙肽50ug/kg,分7次注射，24h后处死动物。胰腺腺泡细胞广泛萎缩、坏死，胰腺小叶间隙增宽。

2. 血清淀粉酶情况

C57BL/6J小鼠，每小时腹腔注射雨蛙肽50ug/kg,分7次注射，24h后处死动物。腹腔静脉取血，1500r/min，10min，4℃离心，取血清行淀粉酶检测。

3、炎细胞浸润情况

C57BL/6J小鼠，每小时腹腔注射雨蛙肽50ug/kg,分7次注射，24h后处死动物。取胰腺组织，用10%福尔马林溶液浸泡48h，随后制成石蜡切片，行免疫组织化学检测。

4、胰腺组织炎症因子表达

C57BL/6J小鼠，每小时腹腔注射雨蛙肽50ug/kg,分7次注射，24h后处死动物。

本实验采用昆明种6-8周龄的健康成年小鼠，体重均在33±2g，SPF级。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京斯贝福生物科技股份有限公司，动物用水为实验室制UP水经过除菌处理。饲养及实验操作均于具有检验合格资质的SPF级屏障动物室内进行，并且实验动物以完整的包装直接进入屏障实验室，观察室适应7天后无异常情况，方可进行实验。所有实验中小鼠均引颈处死，尽量减少动物手术创伤程度及失血量。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

1. 该模型鉴定和评价的技术方法和指标体系，符合溃疡性结肠炎的病理特点，尤其与溃疡性结肠炎反复发作、迁延不愈的临床特点高度相似。

（1） 疾病活动指数

（2） 结肠指数

（3） 结肠组织大体评分

（4） HE 染色病理观察

（5） MPO 酶活性检测

2. 与国内外现有模型的异同

现有的溃疡性结肠炎的造模方法有单一化学法刺激、免疫法、免疫复合法、基因修饰法。虽然现在建造UC动物模型的方法多种多样，但是依旧存在着或多或少的缺陷。理想模型要简单易操作，同时尽可能全面、准确的模拟人类UC的病理生理学特点和表现，既要与自发的炎症诱因相近，又要符合肠道炎症进展、组织损伤进展等，同时模型病变尽量维持较长时间，能尽量反映慢性病变的过程和特点，以满足实验的需求。而目前尚缺乏能满足这些要求的模型，且已有模型以急性损伤模型为主。故亟待寻找更好的，具有良好重复性、稳定性，并且操作简单的动物模型，从而为研究UC发病机制、研发治疗新药物提供良好的基础。

3. 本研究的主要创新点或技术关键

3.1 创新点

本模型采用诱导剂联用的方法，建立慢性、炎症维持时间长且病程稳定的小鼠慢性 UC 造模方法。该模型改进了传统溃疡性结肠炎模型的病程短、稳定性差、模型指标缺少特异性等问题，更大程度的模拟了临床慢性溃疡性结肠炎病理指标。

3.2 关键技术

采用噁唑酮和2,4,6-三硝基苯磺酸两种诱导剂联用、致敏与感染相结合的方法，建立了新慢性、炎症维持时间长且病程稳定的小鼠慢性 UC 模型方法。

4. 可行性分析

4.1 前期摸索研究充分，通过阅读大量中外文献，较充分的了解溃疡性结肠炎疾病以及模型建立过程中的问题。

4.2 实验单位具备动物饲养许可证以及较先进的实验器材和检测设备。

4.3 通过阅读大量中外文献和走访调研，噁唑酮和三硝基苯磺酸在临床上应用广泛，效果明显，具有可行性。