先天性无巨核细胞血小板减少症基因敲除斑马鱼模型

先天性无巨核细胞血小板减少症(CAMT)是一种由巨核细胞减少引起的罕见的遗传性血液病，表现为（或 临床表现为）血小板减少症和巨核细胞的缺失，大多数CAMT患者（I型和II型）都是由唯一已知的血小板生成素(TPO)受体MPL（骨髓增生性白血病蛋白）基因的突变引起的。CAMT的预后较差，骨髓或干细胞移植(HSCT)是唯一可以治愈这种基因遗传疾病的方法。虽然小鼠Mpl的破坏会导致类似于人CAMT的严重血小板减少症表型，但子宫内胚胎发育不全使小鼠较难进入发育早期。已有的斑马鱼血小板缺陷突变体均为血小板减少的突变体，主要为吗啉代敲低导致的暂时性的血小板减少，这些突变体均不可稳定遗传，无法对其表型进行逐代追踪或者长期研究，所以构建一个长期稳定可遗传的血小板疾病模型尤为重要。我们试图建立一个先天性无巨核细胞血小板减少症斑马鱼模型。另外，利用该模型构建药物筛选平台具有独特的优势，有望筛选出安全可用、有显著疗效、治疗效果稳定的对CAMT的药物，对现时解决CAMT预后不良等问题具有重要意义。

在本研究中我们使用了野生型AB品系斑马鱼，使用TALEN技术，并通过基因突变筛选，制备mpl无义突变（mpl-/-）的斑马鱼个体，最后得到mpl 基因的外显子3处包含8bp缺失和48bp插入(mplΔ8+48)的突变品系（以下简称mplsmu3），并发现mplsmu3是功能丧失的突变体。相对于WT，mplsmu3从幼年时期到成年时期都出现严重的血小板减少症，并伴有成年期HSPC缺陷，与mpl 缺陷小鼠的HSPC缺陷和CAMT患者的骨髓衰竭相似；同时我们发现mpl 的突变严重破坏了血小板前体细胞的增殖；血小板减少的mplsmu3斑马鱼与CAMT患者一样，都表现出不易止血且出血倾向增加症状，这都表明mplsmu3斑马鱼品系模拟CAMT表型。通过TPO与IL-11给药，相对于WT，mplsmu3的胚胎中血小板明显减少，并且对TPO 的反应丧失；IL-11可以通过补偿Tpo/Mpl 血小板生成作用来缓解mplsmu3斑马鱼中的CAMT。证明此突变体还可以作为一个新药物筛选的动物模型，帮助筛选新的可治疗CAMT的小分子化合物药物，该模型在血小板生成药物评估和筛选中具有巨大的潜在应用。

图1. TALEN质粒示意图

图2. mpl靶点设计

根据mpl第三个外显子的目标序列设计靶点, 构建斑马鱼mpl TALEN质粒, 体外合成mp1 TALEN mRNA。于斑马鱼胚胎单细胞时期通过显微注射技术将mp1 TALEN mRNA注射进斑马鱼胚胎单细胞，根据TALEN技术并通过基因突变筛选，制备mpl无义突变（mpl-/-）的斑马鱼个体。

我们筛选得到的斑马鱼是在mpl 基因的外显子3处包含8bp缺失和48bp插入(mplΔ8+48)的突变品系（以下简称mplsmu3）。该mRNA编码截短的mpl 蛋白，该蛋白缺少两个纤连蛋白3型结构域和跨膜结构域。预测mplsmu3是功能丧失的突变体。

图4. 野生型和mpl-/-突变体中的mpl转录本存在形式

同时我们检测了野生型与mpl-/-突变体内mpl转录本的存在形式。结果显示，在野生型中只存在正常的mpl转录本，而突变体中只存在突变形式的mpl转录本，因此，我们获得的mpl-/-突变体斑马鱼确实是mpl功能缺失的突变体。

图5. mplsmu3斑马鱼血小板和造血干祖细胞表型

图6. mplsmu3斑马鱼红系，淋系和髓系细胞表型

我们将mpl 突变体和Tg(cd41:eGFP)转基因斑马鱼杂交，并检测血小板和HSPC的变化，其中血小板细胞为GFPhigh，造血干/祖细胞（HSPC）为GFPlow，发现mplsmu3在胚胎期出现严重的血小板减少症，同时通过qRT-PCR检测得编码血小板相关基因的表达水平也降低。因此mplsmu3模拟CAMT表型。通过c-myb整胚原位杂交染色发现在mplsmu3幼鱼中HSPC的发育不受影响，且qRT-PCR检测得其他谱系细胞包括红系（alas2）和髓系（mpx）特异基因的表达水平没有改变。通过O-dianisdine 以及hbae1、rag1整胚原位杂交染色发现红细胞，淋巴细胞和骨髓细胞在mplsmu3突变体中也不受影响。

图7. mplsmu3斑马鱼的成年HSPC缺陷

mplsmu3突变体能够整体正常发育并存活到成年。荧光激活细胞分选（FACS）分析表明，mplsmu3突变体从胚胎期到成年期都表现出严重的血小板减少症，并伴有成年期HSPC缺陷，与mpl 缺陷小鼠的HSPC缺陷和CAMT患者的骨髓衰竭相似。

图8. mplsmu3突变体血小板前体细胞的增殖缺陷

为了研究mplsmu3突变体的血小板增殖情况，利用BrdU（5-溴-2'-脱氧尿苷）标记，对BrdU以及cd41:eGFP+进行免疫荧光染色，发现mpl 的突变严重破坏了血小板前体细胞的增殖。在成鱼KM中的观察也证实了mplsmu3突变体的血小板增殖减少。mplsmu3突变体中的血小板减少症是由血小板前体细胞的增殖减少引起的。

图9. mplsmu3突变体的止血缺陷

为了确定mpl 缺陷是否影响斑马鱼的血小板功能，我们通过损伤幼年时期以及成年时期的mplsmu3突变体，检测血小板凝结情况。我们发现相对于WT以及Tg(cd41:eGFP)，mplsmu3突变体的止血时间（Time to occlusion, TTO）延长很多，同时Tg(cd41:eGFP);mplsmu3突变体血小板聚集数量更少，表明mplsmu3突变体的凝结缺陷主要归因于血小板数量的减少。这些结果表明，血小板减少的mplsmu3斑马鱼与CAMT患者一样，都表现出不易止血且出血倾向增加症状。

图10. mplsmu3突变体对血小板生成剂与其他细胞因子的反应

为了更好地使用此Tg(mpl:eGFP)smu4品系进行药物评估和筛选，我们同时还构建了Tg(mpl:eGFP)smu4;mplsmu3转基因突变斑马鱼，用于测试对临床细胞因子的药物反应，如TPO和重组人白介素11（IL -11）。正如预期的那样， mpl 突变的胚胎中mpl:eGFP+血小板明显减少，并且对TPO 的反应丧失。另外我们发现IL-11增加了WT胚胎中mpl:eGFP+血小板的数量，表明斑马鱼mpl:eGFP+细胞对哺乳动物细胞因子的保守反应。此外IL-11还增加了mplsmu3中的mpl:eGFP+ 细胞，表明CAMT可被IL-11缓解。这些结果表明，IL-11可以通过补偿Tpo/Mpl 血小板生成作用来缓解mplsmu3斑马鱼的CAMT，证明此突变体还可以作为一个新药物筛选的动物模型，帮助筛选新的小分子化合物药物来治疗CAMT，该模型在血小板生成药物评估和筛选中具有巨大的潜在应用。

1、CCKBR基因敲除及高盐饮食小鼠血压情况

高盐喂养8周后，通过左颈动脉插管法检测小鼠的血压，我们发现，胃泌素受体敲出小鼠的血压相比于野生型小鼠明显升高。给予高盐饮食之后，胃泌素受体敲除小鼠的血压进一步升高。而野生型小鼠的血压没有明显升高。说明小肠CCKBR确实能够参与小鼠血压的调节。

2. CCKBR基因敲除及高盐饮食小鼠尿钠情况

我们使用代谢笼对四组小鼠的尿液进行收集并检测，结果表明与野生型小鼠相比，胃泌素受体敲除小鼠的尿钠水平降低。和给予高盐饮食的野生型小鼠相比，给予高盐饮食的胃泌素受体敲除小鼠的尿钠水平也显著降低。说明CCKBR基因敲除及高盐饮食能够诱导小鼠钠水代谢异常，进而诱发高血压。

3. CCKBR基因敲除及高盐饮食小鼠小肠刷状缘膜上NHE3调节蛋白的表达

为了进一步确定胃泌素受体敲除后，小肠绒毛刷状缘膜上NHE3调节蛋白的作用，我们提取了CCKBR+/+小鼠和CCKBR-/-小鼠对照组和高盐组小肠的膜蛋白，我们发现对照组CCKBR-/-小鼠和对照组CCKBR+/+小鼠相比，NHE3、NHERF1、NHERF2、NHERF3、ezrin和IRBIT的表达升高，高盐饮食之后，CCKBR-/-小鼠小肠膜蛋白中NHE3、NHERF1、NHERF2、NHERF3、ezrin和IRBIT的表达进一步升高。这说明胃泌素受体缺失之后，胃泌素对NHE3调节蛋白的抑制作用消失，进一步诱发钠水平衡失调以及高血压的发生发展。

这项研究中建立的CAMT斑马鱼可以为新型抗血小板减少症药物的评估和筛选以及研究mpl 依赖性血小板的发育提供一个合适的动物模型。与此同时，我们还创建了特异标记血小板的转基因系品系Tg(mpl:eGFP)smu4，用来标记与探索血小板的发育过程。利用CAMT斑马鱼模型与mpl 转基因斑马鱼，将为研究血小板生成以及药物评估筛选提供一个有价值的工具。