三转基因银屑病小鼠模型

一、疾病名称

银屑病（牛皮癣，Psoriasis）是一种以表皮过度增生和真皮慢性炎症反应为特征的常见皮肤病。白色人种发病率较高约为2-5%，黄种人发病率较低约为0.5%, 难根治，易复发。目前发病原因不明，与呼吸道感染，胃炎，饮食习惯，精神紧张、忧虑，不当使用激素药物等有关。

二、疾病临床表现及致病机制

（一）银屑病根据临床表现可分为四种类型：

1.寻常型银屑病

为最常见的一型，多急性发病。典型表现为境界清楚、形状大小不一的红斑，周围有炎性红晕。稍有浸润增厚。表面覆盖多层银白色鳞屑。鳞屑易于刮脱，刮净后淡红发亮的半透明薄膜，刮破薄膜可见小出血点（Auspitz征）。皮损好发于头部、骶部和四肢伸侧面。部分患者自觉不同程度的瘙痒。

2.脓疱型银屑病

较少见，分泛发型和掌跖型。泛发性脓疱型银屑病是在红斑上出现群集性浅表的无菌性脓疱，部分可融合成脓湖。全身均可发病。以四肢屈侧和皱褶部位多见，口腔黏膜可同时受累。急性发病或突然加重时常伴有寒战、发热、关节疼痛、全身不适和白细胞计数增多等全身症状。多呈周期性发作，在缓解期往往出现寻常型银屑病皮损。掌跖脓疱病皮损局限于手足，对称发生，一般状况良好，病情顽固，反复发作

3.红皮病型银屑病

又称银屑病性剥脱性皮炎，是一种严重的银屑病。常因外用刺激性较强药物，长期大量应用糖皮质激素，减量过快或突然停药所致。表现为全身皮肤弥漫性潮红、肿胀和脱屑，伴有发热、畏寒、不适等全身症状，浅表淋巴结肿大，白细胞计数增高。

4.关节病型银屑病

又称银屑病性关节炎。银屑病患者同时发生类风湿性关节炎样的关节损害，可累及全身大小关节，但以末端指（趾）节间关节病变最具特征性。受累关节红肿疼痛，关节周围皮肤也常红肿。关节症状常与皮肤症状同时加重或减轻。血液类风湿因子阴性。

（二）目前认为，本病的发生不是单一的原因，可能涉及多方面。

1.遗传

相当一部分患者有家族性发病史，有的家族有明显的遗传倾向。一般认为有家族史者约占30%。发病率在不同人种差异很大。银屑病是遗传因素与环境因素等多种因素相互作用的多基因遗传病。本病患者的某些HLA抗原出现率显著增高。银屑病与其他疾病（如类风湿性关节炎，特应性皮炎等）遗传位点可能存在重叠。

2.感染

许多学者从体液免疫（抗链球菌组），细胞免疫（外周血及皮损T细胞）、细菌培养和治疗等方面均证实链球菌感染与银屑病发病和病程迁延有关。在银屑病患者，金黄色葡萄球菌感染可使皮损加重，这与金葡菌外毒素的超抗原有关。本病的发生与病毒（如HIV病毒）和真菌（如马拉色菌）感染虽然有一定关系，但其确切机制尚未能最后证实。

3.免疫异常

大量研究证明银屑病是免疫介导的炎症性皮肤病，其发病与炎症细胞浸润和炎症因子有关。

4.内分泌因素

部分女性患者妊娠后皮损减轻甚至消失，分娩后加重。

5.其他

精神神经因素与银屑病的发病有一定关系。饮酒、吸烟、药物和精神紧张可能会诱发银屑病。

银屑病是人类特有的一类疾病，在动物中少见，银屑病动物模型的制作主要采用化学制剂诱导，基因修饰或组织移植等方式制备，可以在一定程度上模拟银屑癣的病理表型、慢性炎症等，但是各有优缺点。信号传导与转录激活因子3（signal transducerand activator of transcription 3，STAT3）是STAT转录因子家族的一员，STAT3参与皮肤伤口的愈合、角质细胞迁移、毛囊生长、抵抗皮肤的放射损伤等，皮肤转基因表达活化的STAT3可引发类似银屑病的病变，而抑制STAT3表达可以改善银屑病症状；尿激酶型纤溶酶激活剂（Plasminogenactivator, urokinase，PLAU）是多种血纤维蛋白溶酶原的激活因子，PLAU 和PLAU受体（Plasminogenactivator, urokinase receptor，PLAUR，）也叫做UPAR或CD87，都在皮肤组织表达，PLAU/PLAUR表达升高可能是银屑病发生的重要原因。利用转基因技术，将STAT3、PLAU和PLAUR同时转入小鼠基因组，建立皮肤特异表达三种基因的转基因小鼠，小鼠表现毛囊发育异常、表皮过度增生和慢性炎症，可以作为多病因综合小鼠银屑病。

用PCR的方法克隆人PLAU，PLAUR及鼠STAT3三种基因的开放阅读框，，均插入表皮特异性表达启动子下游构建人PLAU，PLAUR及鼠STAT3三种表达载体。用显微注射法将三种混合后的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，制备三转基因银屑病小鼠

用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，转入到假孕受体ICR小鼠中，小鼠出生后9-14d提取基因组DNA，用PCR扩增目的基因片段来检测转基因小鼠，三种目的基因片段分别为PLAU基因545bp，PLAUR基因475bp，STAT3基因550bp（图1）。

图1 PCR鉴定转基因小鼠基因型

注：P：阳性对照；N：阴性对照；W：空白对照；M：DNA相对分子质量标记； 1、4、7是F0代阳性转基因小鼠；2、3、5、6、8是F0代阴性小鼠。

（二）人PLAU，PLAUR及鼠STAT3三种基因的表达

首先用Western blot 分析1月龄的转基因小鼠皮肤中人PLAU，PLAUR及鼠STAT3的表达情况，结果显示三种蛋白在皮肤中均有表达，表达量各有差别（图2）。

注：WT：野生型小鼠；TG1、TG4、TG7：转基因小鼠；内参：β-actin。

（三）转基因小鼠与同龄野生型小鼠表皮差异

Westernblot 结果显示TG4皮肤中主要高表达PLAU和STAT3，而TG7皮肤中PLAU，PLAUR和STAT3均高表达。 和TG4小鼠比较TG7小鼠表型更明显，说明三种基因同时表达对病理发生是关键。TG7小鼠在1月龄就表现腹部毛发稀疏，无光泽，表皮粗糙，至4月龄表现典型腹部皮肤红肿和炎症（图3）。皮肤炎症主要表现在腹部，背部表型不明显。除皮炎表型外，小鼠生育和发育无异常。

（四）皮肤病理表型

选用4月龄的转基因阳性和同龄野生小鼠，取背部及腹部皮肤，HE染色，镜下观察显示，转基因小鼠真皮变簿（图4A），表皮过度角化和棘层增厚（图4B），毛囊减少和发育异常，部分毛囊内未见毛干（图4C），角化不全区域内可见中性白细胞构成的小脓肿（Munro氏小脓肿）和真皮炎细胞浸润（（图4D）。

图4 病理观察

注：对4月龄野生型小鼠（WT）和三转基因基因小鼠（TG7）的腹部皮肤进行H&E染色和病理观察，显示转基因小鼠真皮变薄（A，白色箭头所示），表皮过度角化（B，黑色箭头所示）和棘层增厚（B， 黄色箭头所示），毛囊减少和发育异常（C，红色箭头所示），出现Munro氏小脓肿（D，绿色箭头所示）和真皮炎细胞浸润（D，蓝色箭头所示）。