Nap1l5基因敲除心肌肥厚小鼠模型

一、疾病概述 肥厚型心肌病 ( Hypertuophic cardiomyopathy, HCM) 是一种器质性心脏疾病，主要表现为左心室和( 或) 右心室及室间隔不对称肥厚、心室腔变小、心室顺应性降低。 病因：肥厚型心肌病是常染色体显性遗传性疾病，60%～70%为家族性，30%～40%为散发性，家族性病例和散发病例、儿童病例和成年病例具有同样的致病基因突变。 临床表现：1.以青壮年多见、常有家族史。 2.可以无症状，也可以有心悸、劳力性呼吸困难、心前区闷痛、易疲劳、晕厥甚至猝死，晚期出现左心衰的表现。 3.梗阻性肥厚型心肌患者胸骨左缘可出现粗糙的收缩中晚期喷射性杂音，可伴震颤，应用洋地黄制剂、硝酸甘油、静点异丙肾上腺素及Valsalva动作后杂音增强，反之应用β受体阻滞剂、去甲肾上腺素、下蹲时杂音减弱。有些病人闻及S3及S4心音及心尖区相对性二尖瓣关闭不全的收缩期杂音。 临床诊断：超声心动图提示左心室壁或（和）室间隔厚度≥15mm，排除了其他引起心肌肥厚的原因如高血压病、风湿性心脏病二尖瓣病、先天性心脏病（房间隔、室间隔缺损）及代谢性疾病伴发心肌肥厚。二、模型背景1、Nap1l5基因信息• 敲除基因名称（ NCBI 号）： Nap1l5（ 58243）敲除基因 NCBI 网址链接： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/58243敲除基因名称（ MGI 号）： Nap1l5（ MGI: 1923555）敲除基因 Ensembl 网址链接：)，它们的印记状态在人类和小鼠之间保存。在分子水平上，印迹基因由染色质标记的表观遗传标记控制，包括DNA甲基化或抑制组蛋白修饰，以沉默一个亲本等位基因，从而导致单等位基因表达[4]。父母的冲突或亲属关系理论提出的摩尔和黑格表明[5],在哺乳动物中,父亲一般地表达了印迹基因作用于胎盘促进萃取母亲提高后代的资源开发和健身,而母亲般地印迹基因表达行为限制保护产妇胎儿生长资源长期母亲的生殖健康。印迹基因还可以通过影响细胞增殖或凋亡直接作用于胎儿，也可以通过影响母体营养物质通过胎盘的通量来影响胎儿生长。最近的证据也表明，印迹基因在认知行为中的作用，因为父系表达的Peg3基因失活研究表明，小鼠缺乏母性照料，从父亲那里遗传了一个空等位基因的雌性小鼠，会导致泌乳能力减弱，无法养育幼鼠[6]。一些实验室的工作也表明，通过体细胞核移植克隆的动物的不完全表观遗传重编程导致印迹基因的异常表达，可能导致胎盘肿大[7, 8]。对这类基因的初步研究突出了其在一般生长发育中的重要作用[9]。最近，很明显，这些基因也可能以一种高度特定的方式对大脑的发育和随后的行为表型做出贡献[10, 11]。 NAP1L5 (Nucleosome Assembly Protein 1 Like 5)是一种蛋白质编码基因。与NAP1L5相关的疾病包括Beckwith-Wiedemann综合征。该基因的一个重要同源基因是NAP1L1。可以影响身体的几个部分。婴儿和儿童在8岁之前通常都比正常身高要大，这时生长速度减缓，导致成人的平均身高。身体的症状可能包括一方或地区越来越比另一边(不对称增长或hemihyperplasia)、脐膨出或其他腹壁缺陷出生时,低血糖(低血糖)在婴儿期,异常大的舌头(巨舌),异常大的腹部器官,折痕或坑附近的皮肤的耳朵,和肾脏异常。受影响的儿童罹患肿瘤的风险更高，尤其是一种罕见的肾癌——Wilms肿瘤，一种肌肉组织癌——横纹肌肉瘤，以及一种肝癌——肝母细胞瘤。然而，Nap1L5是否会参与免疫反应，影响炎症作用，以及在结核病及心血管疾病中的功能及作用机制还有待我们进一步探究。参考文献：1. Mcgrath, J. and D. Solter, Completion Of Mouse Embryogenesis Requires Both the Maternal And Paternal Genomes. Cell, 1984. 37(1): p. 179-183.2. Monk, D., et al., Limited evolutionary conservation of imprinting in the human placenta. Proceedings Of the National Academy Of Sciences Of the United States Of America, 2006. 103(17): p. 6623-6628.3. Morison, I.M., J.P. Ramsay, and H.G. Spencer, A census of mammalian imprinting. Trends In Genetics, 2005. 21(8): p. 457-465.4. Lewis, A., et al., Imprinting on distal chromosome 7 in the placenta involves repressive histone methylation independent of DNA methylation. Nature Genetics, 2004. 36(12): p. 1291-1295.5. Moore, T. and D. Haig, Genomic Imprinting In Mammalian Development - a Parental Tug-Of-War. Trends In Genetics, 1991. 7(2): p. 45-49.6. Li, L.L., et al., Regulation of maternal behavior and offspring growth by paternally expressed Peg3. Science, 1999. 284(5412): p. 330-333.7. Mann, M.R.W., et al., Disruption of imprinted gene methylation and expression in cloned preimplantation stage mouse embryos. Biology Of Reproduction, 2003. 69(3): p. 902-914.8. Suemizu, H., et al., Expression profiling of placentomegaly associated with nuclear transplantation of mouse ES cells. Developmental Biology, 2003. 253(1): p. 36-53.9. Reik, W., et al., Imprinted genes and the coordination of fetal and postnatal growth in mammals. Novartis Found Symp, 2001. 237: p. 19-31; discussion 31-42.10. Davies, W., A.R. Isles, and L.S. Wilkinson, Imprinted genes and mental dysfunction. Ann Med, 2001. 33(6): p. 428-36.11. Isles, A.R. and L.S. Wilkinson, Imprinted genes, cognition and behaviour. Trends Cogn Sci, 2000. 4(8): p. 309-318.

1 项目策略图

2 项目策略概述 利用 CRISPR/Cas9 技术，设计并体外转录 gRNA，将 Cas9、 gRNA 同时注射到小鼠的受精卵中。Cas9 蛋白在 gRNA 引导下结合到靶位点进而造成 DNA 双链断裂，从而实现靶位点碱基序列缺失，实现基因敲除。

3 gRNA 序列信息

4.构建PE诱导的心肌肥大细胞模型，检测ArmH4过表达以及敲低后心肌肥厚分子标志物水平，分别提取总RNA，将内源性GAPDH的mRNA含量设为对照，通过qRT-PCR检测心肌肥厚指标Anp、Bnp、Myh6、Myh7的mRNA水平。

因现阶段小鼠模型仍处于繁育阶段，所以相关实验主要集中在细胞上。

为了探究Nap1l5在心肌肥厚中的功能，我们首先检测了PE诱导的肥厚的心肌细胞中的Nap1l5中的mRNA的表达水平，发现Nap1l5在PE诱导的肥厚的心肌细胞中的表达显著上调（图1A），同时发现在TAC术后的心肌肥厚模型中Napll5的表达同样显著上调（图1B），说明Nap1l5在心肌肥厚的发生中可能发挥重要功能。

为了进一步验证Nap1l5在心肌肥厚中的功能，我们通过siRNA对心肌细胞中的Nap1l5进行了敲低，图1C为敲低水平的检测，证明siNap1l5能够显著敲低Nap1l5的表达；敲低Nap1l5后，心脏组织心肌肥厚标志物Anp、Bnp在心肌细胞中的mRNA的相对表达水平明显受到了抑制，而Myh6却明显上调（图1D）；而Nap1l5的过表达正好有相反的结果（图1F），说明Nap1l5在体外确实可以促进心肌细胞的肥厚。

总之，研究结果表明，敲低Nap1l5可以缓解心肌肥厚的发生，而过表达Nap1l5可以促进心肌肥厚的发生。

图1. Nap1l5 可以促进心肌肥厚。（A、B）Nap1l5及心脏组织心肌肥厚标志物Anp、Bnp、Myh7和Myh6在PE处理的心肌细胞及心脏TAC模型中的mRNA的相对表达水平；（C）Nap1l5敲低水平检测；（D）敲低Nap1l5后，心脏组织心肌肥厚标志物Anp、Bnp、Myh6在心肌细胞中的mRNA的相对表达水平；（E）过表达Nap1l5的水平检测；（F）过表达Nap1l5后，心脏组织心肌肥厚标志物Anp、Bnp、Myh6在心肌细胞中的mRNA的相对表达水平；*P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001 vs Control（A）、Sham（B）、siNeg（C、D）、AdEGFP（E、F），P < 0.05，## P < 0.01，### P < 0.001 vs Control组。

鉴定结果解读：

Ⅰ. 65#, 67#, 72#, 80#, 81#纯合；

Ⅱ. 57#, 77#野生型；

模型动物饲养在武汉大学人民医院动物房SPF级动物实验室，实验动物使用许可证SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特点

门采用专用净化密闭门并配备观察窗。单向走道呈顺时针走向设计。屏障系统内共有大鼠饲养室1间，小鼠饲养室3间，隔离观察室1间，实验准备室1间，洁物存放室1间，清洗消毒室1间。此外，屏障系统外配有监控室、机房和配电室等。

（2）设计参数

室内温度：20～26°C；日温差：≤4°C；相对湿度：40%～70%；换气次数：15～20次/h；气流速度：≤0．2m/s；压强梯度：20～50Pa；空气洁净度：7级；菌落数：≤3个/皿；氨浓度：≤14mg/m3；噪声：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；动物照度：15～20lx；昼夜明暗交替时间：12/12h。

（3）通风和空调系统

动物实验室采用全新风中央空调通风系统。空气经过初、中、三级过滤器后进入实验室内环境。

（4）照明系统

一更、淋浴、二更、气闸、清洁走道、洁物存放处、污物走道、缓冲间和清洗消毒间、动物饲养室、实验准备间、隔离观察室和功能实验室等安装有手动和自动开关，根据实际需要，调节控制室内照明灯。未启用房间、清洁走道、洁物存放处、污物走道等在每日中午12点和晚上8点开启紫外线灯照射1h。

（5）通讯系统

因为SPF级动物实验室的环境和设施具有特殊要求，人员进入后不能随意出入，而室内外的联系又十分重要，故室内各房间均安装内部电话机，按照房间顺序编排电话号码，各室内电话可相互连通，并均与监控室总机保持联系，保证实验室内外信息的及时沟通。

（6）监控系统

对SPF级动物实验室的出入口、走道、实验动物饲养室、功能操作室等重要位置均安装了可作270°旋转的摄像机，能够及时了解设施的运行状态；也能有效督促实验人员执行科学的操作规程，避免人为因素造成室内环境和设施的污染；并对整个实验期间的动物状态和反应进行观察，减少对动物的滋扰。

（7）供水系统

SPF级实验动物饮用水以纯净水为宜。本实验室采用管道供水，将处理后的纯净水用塑胶管道输送到屏障系统内实验准备室，设置接水槽，为实验动物供应灭菌的饮用水和屏障系统内用水。要经常更换和清洗输水管道，清洗笼具的用水添加适当比例的84消毒液。

（8）供电系统、警报系统和消防设施

SPF级动物实验室要求全天候不间断供风和供电，如果出现故障，不能及时发现和处理，就可能导致环境设施的污染、动物感染或死亡，造成严重后果。因此应对SPF级动物实验室使用独立稳定的供电系统，并配备有应急电源。在中央空调机房控制室安装风机故障警报系统，以便及时检修和维护，保证设施的安全运行。

（9）消毒灭菌设备

为防止外界物品进入SPF级动物实验室时所携带的细菌污染室内环境和造成动物交叉感染，按照不同物品的特性，进行紫外线照射消毒、渡槽消毒液消毒或专用的机动门真空灭菌器消毒。

（10）动物饲养笼具

饲养大、小鼠的笼具聚碳酸脂材料的塑胶笼具，具有高透明、耐高压、耐高温、耐酸碱等特点。通用的不锈钢笼具长、宽、高分别为40、30、20cm，适用于单笼饲养有特殊要求的实验动物，配有底盘和食槽，确保实验动物有充足的采食和活动空间，同时也保证室内环境的清洁。

（11）垫料的选择和使用

在使用塑胶垫料时，垫料是大小鼠直接接触的铺垫物，起到吸湿、保暖和造窝的作用。垫料的好坏直接影响到大小鼠术后的恢复、生长发育和繁殖性能。目前，所使用的垫料主要有玉米秸垫料、刨花垫料。

（12）饲料配制

大小鼠的生产型饲料和维持型饲料必须严格按照国家标准，进行科学配制生产。每半年检测一次饲料的微生物指标和有效营养成分指标，保证饲料的质量。

Nap1l5敲除小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技术的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外显子或几个总要的外显子功能区敲除掉，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。

CRISPR/Cas9技术的优点在于其对基因进行定位的精准编辑，在向导RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，细胞基因组DNA（被看成外源DNA）将被准确剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要满足几个条件。第一，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（NGG）。第二，向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。

NAP1L5(Nucleosome Assembly Protein 1 Like 5)是一种蛋白质编码基因。与NAP1L5相关的疾病包括Beckwith-Wiedemann综合征。其主要在儿童发育时期发挥功能，引起一些疾病，而对于该基因在人类衰老阶段是否会在心脑血管疾病中发挥功能却鲜有研究，该研究为Nap1l5的研究提供了新的方向与思路。