慢性束缚应激诱导大鼠学习记忆障碍模型

应激是人类所处生活环境中普遍存在的一种外界因素[1,2]。现代快节奏的生活、高强度的工作及各种特因环境等应激对机体造成严重的生理和心理上的改变，尤其是对认知能力的改变已成为影响人类身心健康的主要因素之一[3]。束缚，是一种将动物置于无法逃脱的应激环境中，通过行为制动的方式，模拟人类社会中无法避免的拥挤、压力性空间等应激因素，是目前建立单纯心理应激所致学习记忆等神经精神疾病应用最广泛的造模方法之一[4]。

文献中关于建立该模型所使用的大小鼠品系繁多。慢性束缚应激动物模型都采用常用的模式动物, 如大鼠和小鼠。多选用封闭群 Sprague-Dawley、 Wistar大鼠、ICR小鼠、C57BL /6J小鼠等[5-9]。雄性多见。造模周期为14-48 d不等[10]，本研究在前期实验研究和文献的基础上，选用10h/28d慢性束缚应激对Wistar和SD大鼠的学习记忆损伤进行比较研究；另选用Wistar大鼠进行慢性束缚应激造模6h和10h/28d观察对动物学习记忆损伤的影响。确定该模型诱导的认知损伤模型为航天特因环境及现代人类长期处于狭小环境作业诱发的学习记忆障碍机理研究、防护和药物研究提供实验模型。

参考文献：

[1] Bowman RE．Stress-induced changes in spatial memory aresexually differentiated and vary across the lifespan[J]. J Neuroendocrinol,2005, 17(8): 526-535．

[2] Staufenbiel SM, Penninx BW, Spijker AT, et al． Hair cortisol，stress exposure, and mental health in humans: a systematicreview[J]. Psychoneuroendocrinology, 2013，38(8):1220-1235．

[3] 王克柱. 基于奖上操作的慢性束缚应激所致大鼠认知功能损伤及Rg1、Rb1防护作用防护[D]. 北京协和医学院. 2016: 1–151.

[4] 王逸，卢聪，宋广青，陈怡西，武宏伟，王琼，曲丽娜，李莹辉，刘新民. 慢性束缚应激对SD和Wistar大鼠学习记忆能力的影响[J]. 中国实验动物学报, 2014, 22(2):41-44.

[5] Chunhung Chiu, Charngcherng Chyau , ChinchuChen, et al. Erinacine A-Enriched Hericium Erinaceus Mycelium ProducesAntidepressant-Like Effects through Modulating BDNF/PI3K/Akt /GSK-3β Signalingin Mice. International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(341):1-12.

[6] McLaughlin KJ, Gomez JL, Baran SE, et al. Theeffects of chronic stress on hippocampal morphology and function: an evaluationof chronic restraint paradigms. Brain Research, 2007, 1161:56-64.

[7] Kecheng Zhou, Junbin Yin, Huanghui Wu, et al.Danggui-Shaoyao-San, a Traditional Chinese Medicine, Relieved Depression andCognitive Disorder Induced by Chronic Restraint Stress Involved in RegulatingDendritic Spines Remodeling[J]. 2017.

[8] Liming Dong, Yi Wang, Jingwei Lv. Memoryenhancement of fresh ginseng on deficits induced by chronic restraint stress inmice[J]. Nutritional Neuroscience, 2017.

[9] Kezhu Wang, Pan Xu, Cong Lu, et al,. Effects ofginsenoside Rg1 on learning and memory in a reward-directed instrumental conditioningtask in chronic restraint stressed rats. Phytotherapy Research. 2017, 31: 81–89.

[10] Tatyana Buynitsky, David I. Mostofsky.Restraint stress in biobehavioral research: Recent developments. Neuroscienceand Biobehavioral Reviews. 2009,33:1089-1098.

1 动物：SPF级SD、Wistar大鼠和ICR小鼠

2 材料：行为限制器、医用棉签

3 仪器：无

4 模型诱导方法：

慢性束缚组大鼠每天早上9:00开始束缚，束缚强度为6h和10h，连续束缚 28天。束缚时将动物放进大鼠束缚器内（直径6.0 cm，长21.0 cm），用底座固定，保持大鼠四肢固定，不能自由转身。束缚器顶部及四周有数个孔洞，以保持束缚器内空气流通，以防动物窒息死亡。束缚期间，模型大鼠放在临近的隔壁房间，正常组与束缚大鼠隔开，去除束缚后再放回原来的动物笼中。

1 实验材料

（1）药品与试剂：

BDNF，TrkB，Erk1/2，Egr-1，GR和Synapsin-1 rabbit mAb（Cell Signaling）

（2）仪器：

① 行为学检测：大鼠水迷宫计算机监测分析系统、物体识别检测箱、奖励性操作条件反射测试箱

② 蛋白含量检测：制冰机（意大利Icematic公司）、电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）、电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、离心机（德国Eppendorf公司）、全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）、超声细胞破碎仪（美国Sonics公司）、TS-1脱色摇床（江苏海门其林贝乐公司）、双垂直板电泳槽（美国Bio-Rad公司）、Gel Doc XR凝胶成像（美国Bio-Rad公司）、移液枪（德国Eppendorf公司）、分析天平（梅特勒托利多公司）。

2 评价方法

（1）行为学评价:

① 水迷宫空间记忆实验

本实验中，圆形迷宫直径为 159 cm、高 50 cm， 池中水深25. 5 cm 左右，内置平台直径 9 cm、高 24 cm，水温维持在( 24 ± 1) ℃。将迷宫置于空间信息相对丰富的实验环境中，作为动物学习过程中的空间参照物，整个试验周期内保持环境信息固定不变。将迷宫均分为4个象限，将平台置于其中一个象限中央，作为实验中动物逃离水环境的唯一途径，空间记忆阶段保持平台位置固定不变。选择其余3个象限作为动物的入水点将动物面向池壁放入水中，每天训练 3次，每次变换入水点位置(使动物可分别从3个象限入水) ，且每天所有动物入水点的顺序保持一致。每次训练前适应 10 s，使动物获取并学习空间环境信息。设置检测时间为60s后，将动物放入水中，若动物在60 s内找到平台，算作寻台成功并记录其潜伏期，并使其在平台上停留休息10 s。若动物在 60 s内未找到平台，结束此次训练并记录潜伏期为60 s，并引导动物靠近平台使其在平台上停留 10 s。每只动物训练的时间间隔为40 min。每天每只动物3次训练学习的潜伏期平均值，作为评价动物这一天学习能力的指标。经过5d的训练学习后，第6天撤去平台，进行空间探索实验。将动物从原平台象限的对角象限面向池壁放入水中， 检测其在60s内在原平台象限的游程比、时间比，以及穿过原平台所在位置的次数，作为评价空间记忆能力的指标。

② 水迷宫工作记忆实验

空间探索实验结束次日，开始工作记忆实验。工作记忆历时3d，分别将平台置于其余 3 个不同象限中，每天变换平台位置，同一天内平台位置保持不变。每天训练3次，依次从其余3个非平台象限将动物面朝池壁放入水中。训练前不予适应，其余同空间训练阶段一致。计算3天中，第2次训练潜伏期的平均值，作为评价动物学习记忆能力的指标。

③ 新物体识别实验

实验箱为黑色聚酯塑料材质构成的封闭箱，体积为60 cm × 40 cm × 80 cm， 箱体左右两侧各有两排LED灯条照明， 既避免了强光直射对动物行为的干扰，又可以作为计算机对动物行为识别的背景光。顶部采用摄像头观察动物的活动情况及探索过程。实验过程分为3个阶段: 适应期、熟悉期、测试期。适应期为 3d， 每天将动物依次放入实验箱内，熟悉环境10 min。适应期结束后，次日进行熟悉和测试。熟悉期时，将两个完全相同的物体放入实验箱内对称的位置处，此两物体距离侧箱壁、箱后壁的距离均为10 cm。记录大鼠5 min 内对两物体的探索总时间。间隔30 min后，进入测试期。测试期内，将其中一个熟悉物体换为另一个大小相近但形状和颜色不同的新颖物体， 记录大鼠对新颖物体和

熟悉物体的探索时间，用辨别指数 (discriminationindex，DI) 来评价动物的学习记忆能力。辨别指数计算公式为 DI = ( N-F) /( N + F) × 100%，其中N( new) 为新颖物体探索时间，F( familiar) 为熟悉体探索时间。

此外基于该模型行为学评评价方法包括奖励性操作条件反射实验步骤如下：

① 适应模式：

束缚 28 d 后将动物放进测试箱内进行适应训练， 其方法为：束缚大鼠去除束缚器后，在动物笼内恢复 30 min，恢复期间将动物搬进测试箱房间内，适应测试间的环境 30 min。 30 min 后将大鼠按照顺序放进测试箱内，打开操作系统，进入自由适应模式， 将亮灯时间调整为 0 s，即试验中没有信号灯的指示。奖赏物质每 60 ±10 s 自动给出，动物在测试箱内自由的探索，并做出鼻触反应获取奖励。适应期间记录动物鼻触次数及运动路程、平均速度指标。

② 奖励性条件反射实验:

利用奖励性条件反射测试系统，对造模实验动物进行检测。应用自由适应模式，此模式为信号灯亮，奖赏物质给出。以动物探头次数（NP）为评价指标。动物探头喝水反应了动物对饮水盒的位置记忆与探索兴趣程度，此阶段训练的目的使动物得到奖赏物质可在饮水盒内获得的信息；使动物将信号灯亮与奖赏物质之间形成经典条件反射。

③ 奖励性操作条件反射

奖励性条件反射训练结束后，采用连续强化方式，即完成踏板操作1次即可获得一次奖励，直到获得50次奖励或者 30 min 试验时间结束。

④ 奖励性操作条件反射巩固再现及复杂操作

当动物连续3 天在规定的 30 min 内成功获得 50 次奖赏，此算做习得奖励性操作条件反射，然后可以终止实验进行下一步的实验（FR=1）；连续多次踏板操作是指要求动物连续踏板2 次或者 4 次才能获得 1 次奖赏，而连续踏板要求在2 s 或4 s内完成。

（3）蛋白含量检测

① 组织蛋白的提取

每组各3个海马组织，称重，每10mg组织加入100 μl预冷的裂解液；冰上超声破碎，制成10%组织匀浆。再置冰上裂解30 min：将组织匀浆液转移到1.5ml离心管，4℃离心（20min，12000 rpm/min）；取上清液，用BCA法测定蛋白浓度；加4x上样缓冲液，沸水浴变性5min，快速冷却，分装，-80℃冻存备用。

② SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

配制分离胶。将分离胶注入垂直放置的玻璃板缝隙中，顶层加入1cm高度的异丙醇覆盖胶面。室温静置至凝胶与异丙醇之间有一水平的清晰界面，倒掉异丙醇，用滤纸凝胶顶部液体。配制浓缩胶。将配好的浓缩胶注入玻璃板问隙。立即插入齿梳，室温静置30 min左右。电泳。将凝胶插入垂直电泳槽中，小心拔出梳子，加满电泳缓冲液，往梳孔中加入蛋白分子量marker（3μl/孔）和样品（8μl/孔）；电压80 V，当溴酚蓝进入分离胶后,将电压增至120V，继续电泳至溴酚蓝接近分离胶底部。关闭电源，取下凝胶，进行转膜。

③ 转膜

按照凝胶大小，剪PVDF膜和两张Bio-RAD专用滤纸，将剪好的滤纸，海绵垫和夹子在电转移缓冲液中浸泡20min。PVDF膜用甲醇浸泡5min：在转膜夹中，从负极（黑色）到正极（白色）依次排放：海绵垫—滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸—海绵垫，盖好正极板，插入电转移槽，倒入电转移液，盖上盖；冰浴电转，350mA, 1h。

④ 封闭及抗原抗体反应

电转完毕后，将PVDF膜放入含5%脱脂奶粉的TBST中，室温轻摇1h。将PVDF膜封入自封袋中，加入一抗稀释液，将膜完全覆盖，赶出气泡，4℃过夜。一抗杂交后用10%TBST洗10 min，每次温振摇，共3次。洗涤后，将PVDF膜封入自封袋中，加入一抗稀释液，将膜完全覆盖，赶出气泡，室温孵育1h。二抗杂交后用10%TBST洗涤10 min，每次室温振摇，共３次。将A液和B液按1：1比例混匀配制化学发光液，避光保存；将膜放于剪好的自封袋中，均匀滴加发光液，暗处放置3min；置于凝胶电泳显色仪中照相。

(4) 神经递质检测

脑组织中神经递质的检测采用LC-MS/MS分析方法，可同时测定7种脑内神经递质的含量，其中单胺类神经递质包括多巴胺（DA）、肾上腺素（E）、去甲肾上腺素（NE）和 5-羟色胺（5-HT），胆碱类神经递质主要是乙酰胆碱（Ach），

氨基酸类神经递质包括兴奋性氨基酸（谷氨酸 Glu）和抑制性氨基酸（氨基丁酸，

GABA）。

3 评价结果

（1） 行为学结果

① 慢性束缚应激对水迷宫实验（空间探索阶段）的影响

②慢性束缚应激对水迷宫实验（工作记忆阶段）的影响

③慢性束缚应激对新物体识别的影响

此外，本课题组还针对Wistar大鼠的慢性束缚应激（6h和10h/28天）诱导的认知损伤进行探究，行为学检测主要包括奖励性操作条件反射，结果如下所示：

① 慢性束缚应激对大鼠的兴趣及运动能力的影响

各组别的运动路程及平均速度均没有明显变化，这同样说明了慢性束缚应激对大鼠的运动能力和探索兴趣也没显著性影响。行为学检测结束后，我们进行了糖水摄取实验，即给予动物 20%蔗糖水，自由饮水 1 h，从实验结果看到三个组别的糖水消耗量没有明显的变化。此结果再次验证了上述结论。

① 慢性束缚应激损害大鼠奖励性操作条件反射学习能力

慢性束缚大鼠的踏板次数、鼻触次数显著性低于对照组。但随着训练周期的延长大鼠的踏板次数逐渐的升高，并在训练第8天与对照组无明显的差异，因此也致使大鼠的学习效率（LP/NP）呈现逐渐升高的趋势，同样在第 8天基本达到正常水平。以上结果说明了慢性束缚应激阻碍了大鼠的学习能力，随着训练强度的加大可以弥补这种损害作用。

③慢性束缚应激对大鼠奖励性操作条件反射记忆巩固的影响

④慢性束缚应激对大鼠的复杂操作能力的影响

本实验采用的连续多次踏板操作来检测大鼠的复杂操作能力。实验结果如图8。结果显示，在固定比率2和4阶段，各项指标均出现显著性的差异。在 FR=2 阶段，与对照组比较，束缚 6-h 组的踏板次数、鼻触次数指标首先出现显著性差异（day 1）；反应动物踏板操作准确性的指标如 R/NP，R/LP，LP/NP等均在 day 2 出现显著性差异。束缚 10-h 组表现出与束缚 6-h 相似的作用。FR=4阶段，与对照组比较，束缚 6-h 组的踏板次数、鼻触次数、奖赏次数以及比率（R/NP，R/LP，LP/NP）均表现出显著性的差异；束缚 10-h 组则在鼻触次数（day 2，day3）、R/LP（day 2，day 3）、潜伏期（day 2）出现显著性差异。从下图同样可以看出，随着训练周期的增加，动物的踏板次数、奖赏次数以及操作任务的准确性均在逐渐的升高。综上所述，慢性束缚应激可以损害大鼠复杂操作能力，但这种损害作用可以通过大量的操作任务训练来弥补。

图 8. 慢性束缚应激对大鼠的复杂操作能力的影响 (n=7-10，Mean±SEM）。与对照组比

较，*p<0.05，**p<0.01, ***p<0.001有显著性差异。

（2）蛋白含量检测结果

如图9所示，慢性束缚应激（6 h/day, 10 h/day）显著性的减少皮层中糖皮质激素受体（GR）的表达 (p<0.001)。

图9. 慢性束缚应激对大鼠前额皮层内GR蛋白表达的影响（n=3, mean±SEM）。与对照组比较，***p<0.001。

如图10所示，CRS 6-h和CRS 10-h 组别均显著性的降低皮层中BDNF的表达(p=0.002)，BDNF特异性的受体TrkB的表达也显著性降低(p<0.001)。BDNF是神经营养因子家族中的一员，与其高亲和力受体TrkB结合引起下游MAPK信号级联反应在神经细胞的生存、分化、维护生理功能以及认知功能等方面起到重要作用。束缚应激大鼠皮层中总Erk1/2没有变化，但其磷酸化水平显著性降低（p<0.001）。

图10. 慢性束缚应激对大鼠前额皮层内BDNF/TrkB/Erk1/2通路蛋白表达的影响（n=3,mean±SEM）。与对照组比较，**p<0.01，***p<0.001。

如图11，结果表明，应激组动物皮层内 Egr-1 蛋白表达明显的低于 Con组别，差异显著（p<0.001）。

图 11. 慢性束缚应激对大鼠前额皮层内 Egr-1 蛋白表达的影响（n=3, mean±SEM）。与对照组比较，***p<0.001。

如图12显示，与 Con 比较，大鼠经历 28 天的慢性束缚应激后，皮层中Synapsin-1的表达显著性的减少 (CRS 6-h, p<0.001; CRS 10-h, p<0.001)

图 12. 慢性束缚应激对大鼠前额皮层内 Synapsin-1 蛋白表达的影响（n=3, mean±SEM）。与对照组比较，***p<0.001。

（3）神经递质检测

如图13，慢性束缚应激 28days 后，大鼠皮层中Ach的含量没有发生显著性的变化（p>0.05）。慢性束缚应激显著性的升高皮层内兴奋性氨基酸（Glu）的含量，其中 CRS 10-h（p=0.002）较 CRS 6-h（p=0.02）升高较多，抑制性氨基酸（GABA）则没有明显的变化。慢性束缚应激对 E 和 NE 无明显影响，但可以显著性降低 5-HT的含量，并显著性升高 DA 含量。

图 13. 慢性束缚应激对胆碱类神经递质 Ach、Glu、GABA、DA、NE、E和5-HT含量的影响（n=6, mean ±SEM）

本实验采用健康成年SPF级大鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

束缚，是一种将动物置于无法逃脱的应激环境中，通过行为制动的方式，模拟人类社会中无法避免的拥挤、压力性空间等应激因素。由于其对动物没有电击等物理性刺激，减少了动物的躯体应激反应，与获得性无助、不可预测性应激等慢性心理应激模型相比，是建立单纯心理应激所致学习记忆障碍更适宜的造模方法。慢性束缚，是持续时间较长的一种造模方式，一般造模时间大于1 d。更好的模拟了现代社会中，人们面临的压力持续时间增加的情况。本研究通过两种不同的认知行为学评价方法考察束缚应激对SD和Wistar大鼠学习记忆能力的影响。水迷宫定位航行实验是考察动物空间学习记忆能力的一种常用方法。结果表明慢性束缚应激(10 h，28 d)对SD大鼠空间学习记忆的损伤更明显。新物体识别实验是评价动物识别记忆的简单、灵敏的方法。结果表明SD和Wistar模型大鼠在熟悉期表现出与各自对照组相同的探索能力，但是检测期的辨别指数与对照组比出现差异。这排除了探索行为的改变对认知检测结果的干扰，同时表明束缚应激对大鼠的识别记忆能力产生损伤，且对SD大鼠的损伤更明显。水迷宫工作记忆实验结果也表明慢性束缚应激对SD大鼠的非空间学习记忆能力的损伤较Wistar大鼠更明显。两种检测方法中，水迷宫对动物的体力要求较高，其具体体现在游泳速度上。束缚应激在对速度的影响不显著的情况下，可引起空间学习能力、工作记忆的损伤。进而表明体重下降只是应激引起的外周作用的一种表现，与学习记忆能力并没有一定的相关性。

奖励性操作条件反射是一种复杂的条件反射，它涉及到对反应与奖励之间的操作行为后果因果联系的认知。评价指标包括动物的踏板次数、鼻触次数及完成任务所需要的时间。适应训练过程没有条件性刺激和踏板伸出，动物自由的探索测试箱。奖赏适应阶段的鼻触次数能够反映出动物对奖励物质的兴趣程度。实验结果发现，慢性束缚应激大鼠（6h和10h，28天）在适应训练中的鼻触次数、运动路程、平均速度和糖水消耗量与对照组比较均没有显著性差异，表明慢性束缚应激并不会损害动物的运动能力和对奖赏的兴趣。

奖励性条件反射训练中，条件性刺激与奖赏（20%蔗糖水）反应配对出现，动物需要记住只有当蓝色信号灯亮时才能够获得奖励。慢性束缚应激（6h和10h，28天）严重的损伤了激励性条件反射的习得，主要表现在慢性应激组动物的NPs 显著性的低于对照组，说明了慢性束缚应激能够损害动物的奖励性条件反射的获得。同样应激组的NPs并没有像对照组一样表现出上升的趋势， 其可能的原因是，由于慢性应激导致动物获得奖励的次数降低，进而降低了奖励物质的内在价值，动物逐渐失去探索奖励的动机，逐渐停止探索行为。

在奖励性操作条件反射学习过程中：慢性束缚应激（6h和10h，28天）后，动物的LPs、NPs 和LP/NP 显著性的降低。同样实验结果发现，慢性应激组大鼠表现出训练 day1-4 NPs显著性减少，day5-day10恢复正常，表明了训练前给予慢性束缚应激严重损害了操作件反射的获得。但是，通过增加训练次数可能弥补这些损害作用。

动物是在形成操作式条件反射后接受慢性束缚应激，然后将动物按照起初的训练环境引起记忆回放。慢性应激组LP/NP和完成任务需要的时间显著性的低于对照组，说明了应激动物的记忆检索能力受到一定程度的损害，这也说明了慢性束缚应激削弱了准确的回忆操作-后果关联的能力。当获取奖励的规则改变时，动物需要重新付出努力再次学习新的踏板操作-后果之间的关联反应。因此，我们利用高比率操作反应来评价这种行为灵活性。通过我们设定的奖励获取规则，动物仅在2（或 3 s）内连续踏板2次（或4次）才能获取奖励。慢性应激大鼠在训练起初表现出踏板操作的盲目性和连续性，慢性应激大鼠获得的奖励和LP/NP 显著性低于对照组，以及动物不能有效的将奖赏和一系列的踏板操作联系起来，表现出持续性的效率低下。

此外，本实验室和文献均对不同时间慢性束缚应激引起的学习记忆障碍有所研究，即除上述实验外，本课题组还探究了Wistar雌雄大鼠每天束缚6h，连续7天、14天、21天、28天和35天，利用水迷宫实验和穿梭实验进行对学习记忆能力的评价。结果显示以上各组别的模型大鼠和对照组相比各指标都无差异，且模型组大鼠在某些时间点表现出相对对照组学习记忆能力增强的现象。雌性大鼠每天束缚10h，在第28天时，自主活动实验模型组大鼠在水迷宫实验第二天出现总总游程和总时间的延长，但第三天差异消失，这可以一定程度上反映大鼠每天束缚10h、连续28天可能会造成大鼠学习记忆障碍，但模型表现不稳定，需要加长每天束缚时间确保模型的可重复性。因此，将每天束缚时间延长至14h，利用水迷宫实验、穿梭实验、新奇事物实验来评价模型大鼠的学习记忆能力。连续束缚28天后模型组雌雄大鼠在新奇事物实验、水迷宫实验中都表现出与对照组明显差异，故认为雌雄大鼠在每天束缚14h连续28天后导致大鼠学习记忆障碍。且本次研究中慢性束缚应激（10 h/28 d），在新物体识别实验和水迷宫实验中SD大鼠学习记忆能力的损伤较Wistar大鼠明显。另外，慢性束缚应激（6h和10h，28天）能降低Wistar大鼠在奖励性操作条件行为学检测中不同阶段对记忆的主动操作能力、学习记忆获得、维持、再学习能力。此外，课题组还报道了ICR小鼠经慢性束缚应激10h，28天损伤了动物在新物体、物体位置识别实验和水迷宫行为学实验中的学习记忆能力，与对照组相比具有显著性差异。故我们推荐慢性束缚应激10h和14h，28天致使SD和Wistar大鼠新奇事物实验、水迷宫实验中的学习记忆损伤，且14h，28天造模时间更稳定。慢性束缚应激（6h和10h，28天）均能降低Wistar大鼠在奖励性操作条件行为学检测中不同阶段对记忆的主动操作能力、学习记忆获得、维持、再学习能力。慢性束缚应激10h，28天致使ICR小鼠在物体识别实验（新物体和物体位置）和水迷宫实验中的学习记忆损伤。

分子机制结果表明长期束缚应激（6h和10 h/day，28 days）均可引起大鼠BDNF表达减少，继而引起GR介导的BDNF 信号转导受阻。此外Egr-1和Synapsin-1等蛋白表达均明显的降低。神经递质检测发现应激组大鼠前额皮层Ach，E和NE无变化，Glu 显著性升高，5-HT的含量降低。氧化应激检测发现慢性束缚应激10h，28天可引起ICR小鼠血清中丙二醛含量的升高以及降低总抗氧化能力。

模型技术难点在于由于束缚器是树脂材料的圆柱形，顶端有数个通气的小孔，各组动物体重的控制应在适宜范围之内，满足其在束缚器中身体不能翻转，只能保持头部活动保持正常呼吸。另外，在束缚早期由于动物挣扎剧烈，会出现动物窒息的情况，所以一开始需要我们24 h观察，及时排除动物窒息死亡的情形。

与其他应激模式不同：慢性束缚应激是将动物置于无法逃脱的应激环境中，通过行为制动的方式，较好的模拟了宇航员在太空中飞行和现代人类社会长期处于拥挤、狭小空间作业而引起的认知损伤。