先天性小儿畸形Foxi3敲除小鼠模型

小耳畸形的病因目前还不完全明确，环境和遗传因素是目前小耳畸形病因研究的重点。先天性小耳畸形在基因突变致病性研究方面还没有阐明小耳畸形胚胎发育的机制。小耳畸形主要涉及胚胎发育期间第一和第二鳃弓的异常，主要表型涉及外耳发育异常。外耳的耳廓是由第一和第二鳃弓的逐渐融合形成的，在发育过程中第一和第二鳃弓之间是相互作用，两弓之间的凹槽加深，形成外耳道，从胚胎的起源来分析，外耳的发育至少在一定程度上是由第一和第二鳃弓通过后脑的部分区域来介导的，后脑是鳃弓的神经嵴细胞的来源，在后脑的第四段基因突变可以导致外耳的发育缺陷。

小耳畸形主要是指外耳的先天发育性结构异常，其严重程度主要表现为从轻度结构异常到完全性耳廓缺失，并且可伴有外耳道狭窄和外耳道闭锁等一系列先天性外耳异常，轻者耳廓略小于正常， 畸形严重者耳廓全部消失， 绝大多数患者仅遗留花生状或贝壳状的残耳组织。同时一些小耳畸形患者也常合并颅面部畸形，中耳及半侧颜面骨及软组织发育不良等。

FOXI3是转录因子Fox家族成员之一。受FOXI3调控的信号通路和基因很多，包括FGF、BMP、WNT等信号途径及在胚胎发育过程中有重要作用的SIX、EYA和PAX等转录因子。研究显示Foxi3敲除小鼠可检测到Fgf3/8、Wnt8a、Eya1、Six1等基因表达异常；Foxi3敲除鸡可检测到Fgf2/3/19、Dlx5、Six1和Eya1等基因表达异常。Pax-Six-Eya-Dach是控制动物眼、耳、脑神经和肌肉发生及发育的关键基因网络。在斑马鱼和鸡Foxi3敲除的模型胚胎中也检测到类似人OAVS患者的表型。在人的样本中，也有Tassano E等报道了1例具OAVS表型的女孩被鉴定到包含FOXI3基因在内的2.5Mb大小的染色体杂合缺失。

利用Cre/loxP重组系统的原理，进行基因敲除（knockout，KO），制备FOXI3敲除小鼠。小鼠的背景品系是C57BL/6。

(一)设计方案：

Foxi3forkhead box I3 [Mus musculus(house mouse) ]

Gene ID: 232077

Location: 6; 6 C1

Exon count: 2

（二）根据基因信息选择靶点，合成sgRNA

targeting site 1:

tcccaggtataagagacg cgg

M-FOXI3-sgRNA-UP15’TAGGtcccaggtataagagacg

M-FOXI3-sgRNA-DOWN15’aaacCGTCTCTTATACCTGGGA

targeting site 2:

atcgctcctcagacttga tgg

M-FOXI3-sgRNA-UP25’TAGGatcgctcctcagacttga

M-FOXI3-sgRNA-DOWN25’aaacTCAAGTCTGAGGAGCGAT

(三)显微注射

1，超数排卵：15只3-4周龄C57雌鼠注射激素进行超排。

2，受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。

3，雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的ICR雄鼠。

4，受体鼠制备：8-10周龄ICR与结扎的ICR雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。

5，胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次， 150枚卵，5只受体鼠）。

(四)显微注射基因型鉴定

1，剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。

2，基因组DNA提取： 使用全式金（Transgen）公司的基因组DNA提取试剂盒（EE101-12）提取基因组DNA

3，PCR检测：根据序列信息设计检测引物（上海英潍捷基）

M-FOXI3-ko-s 5’CAAATAAGTAGTCAATCCACTCAAACG 61.4℃

M-FOXI3-ko-a 5’TCCCACCCTTAACTCCAATGAC 62.3℃

M-FOXI3-wT-s 5’GGGCTGATTGATCTCTGAGTTC 60.2℃

M-FOXI3-wT-A5’AGGTGCTGAGGAAAGTGTTGAG 60.8℃

M-FOXI3-ko-s&A: TM=61℃ KO 603bp

M-FOXI3-wt-s&A: TM=60℃ WT 496bp

PCR反应体系及扩增程序（TaKaRaRR042A）

l反应体系：

10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Plus)

2.0 μl

dNTP Mixture(2.5 μM)

1.6 μl

引物-S（50 μM ）

0.2 μl

引物-A（50 μM ）

0.2 μl

模板DNA

2.0 μl

LA Taq

0.2 μl

补加ddH2O至总体积

20.0 μl

l扩增程序：

l 6×loadingbuffer 终止反应。

l 用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。

foxi3敲除小鼠纯合子胚胎有耳部畸形表型，外耳明显小于正常，失去正常小鼠耳廓亚结构形态, 外耳道未见，其耳廓形态与人先天性小耳畸形比较类似。