SIVmac239静脉途径感染恒河猴模型

一、 艾滋病概述

艾滋病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（Human ImmunodeficiencyVirus, HIV）引起，以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病，是20世纪危害人类健康和生命最严重的病毒性疾病之一。自美国CDC报道首例艾滋病后，到20世纪80年代中期艾滋病发展成为一个性的流行病。截止2014年底，HIV已感染3690万人，2014年新增感染者200万，2014年因艾滋病死亡120万人。艾滋病在1985年传入我国，截至2015年5月31日，历年累计报告艾滋病530628例，其中艾滋病病人217457例，死亡167159例。艾滋病早已成为关注的公共卫生和社会热点问题，艾滋病的预防与治疗也成为当代生物医学研究的前沿热点之一。

二、艾滋病动物模型简介

艾滋病发病机制研、药物和疫苗的保护性研究及评价等方面在很大程度上依赖理想的动物模型。人们发现HIV以后，用HIV感染过多种动物，但由于种种原因，结果并不理想。研究发现猴免疫缺陷病毒(SIV)感染实验用猴的模型效果比较理想，表现为和AIDS的临床表征，发病过程、免疫缺陷特征等非常相似，加之HIV和SIV有一定的基因同源性，人和猴的生物学特性也较其他动物接近，因而，SIV/SAIDS(猴艾滋病)模型被广泛接受和应用。

SIV是猴获得性免疫缺陷综合征（SimianImmune Deficiency Syndrome，SAIDS）的主要致病病毒，为典型的C型病毒粒子，基因组长度大约为9.2kb，基因组成同HIV-1和HIV-2基本相同，其完整的原病毒基因含有二个LTR以及同HIV类似的基因：gag、pol、vif、tat、rev、env和nef。所有基因在SIV的排列顺序同HIV完全一样。目前国内外对SIV的研究多集中在非克隆株SIVmac251和克隆株SIVmac239上，因为这两个病毒株能在多种猕猴属动物身上引发致死性免疫缺陷综合征，同时伴有CD4+淋巴细胞下降，继发机会性感染病毒性脑膜脑病。这些都与人类AIDS类似。

艾滋病的三种传播途径分别是经血液、性和母婴传播，性传播包括同性传播和异性传播两种方式。艾滋病动物模型的制备首先要考虑其实际应用价值，最好的动物模型可以最大限度的模拟人类疾病，包括使用与自然感染相同或接近的方式建立模型。为充分模拟静脉注射吸毒人群的感染方式，通过静脉途径，病毒直接感染血液中的靶细胞，从而制备静脉途径艾滋病恒河猴感染模型。

1、 实验用病毒：感染毒株为SIVmac239中国恒河猴细胞适应株，使用中国恒河猴PBMCs扩增制备，CEMx174细胞滴定TCID50为3×105/mL。

2、 感染动物：选用体重4-6kg的SPF恒河猴。实验前体检无异常，必须排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相关的4种基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）筛查结果为阴性。所有感染动物必须在ABSL-3室中进行。

3、 感染方法：将SIVmac239病毒原液1:100稀释至1 mL，经后肢静脉接种恒河猴。

4、 SIVmac239静脉感染猴样品采集和指标测定：在感染前和感染后10、17、24、28、42、56、84天采集EDTA抗凝血4mL，分别测定血常规、血浆病毒载量、CD4+/CD8+、CD4+细胞绝对数。

5、 SIVmac239静脉感染猴血浆病毒载量的测定：提取EDTA抗凝血浆中病毒RNA，使用SYBR Green I 实时荧光定量RT-PCR方法测定血浆病毒载量。

6、 SIVmac239静脉感染猴外周血CD4+/CD8+比值及绝对数测定：CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE抗体标记EDTA抗凝全血淋巴细胞，流式细胞仪测定CD4+/CD8+比值，并根据血常规结果，计算出CD4+T细胞绝对数。

1、 SIVmac239静脉感染恒河猴外周血病毒载量结果

8只SIVmac239静脉感染恒河猴血浆载量变化规律基本一致（图1）。Rid1、Rid3、Rid7、Rid9、Rid12、Rid13在SIVmac239感染后4d就检出病毒载量阳性，Rid5、Rid10两只感染猴在SIVmac239感染后7d检出病毒载量阳性。随后，8只SIVmac239静脉感染恒河猴在感染后11d-14d达到高峰，峰值在106至107 copies/mL之间，随后迅速下降。8只感染猴在感染后42d-210d之间载量保持稳定水平，其中，Rid7、Rid13两只感染猴在此期间血浆病毒载量维持在104 copies/mL左右；Rid1、Rid3、Rid5、Rid9、Rid10、Rid12六只感染猴在此期间血浆病毒载量仍保持在较高水平，约为105至106copies/mL之间。

图1 SIVmac239静脉感染中国恒河猴外周血病毒载量结果

Fig.1 The viremia (viral RNA copies/ml plasma)in Chinese-original rhesus macaques infected intravenously with SIVmac239

1、 SIVmac239静脉感染恒河猴CD4+/CD8+比值结果

8只SIVmac239静脉感染恒河猴CD4+/CD8+比值均在感染后10d之内发生应激性增高，随后迅速下降，维持在各自的稳定水平。Rid7感染猴在感染后112天CD4+/CD8+比值发生倒置，之后一直维持在1.0以下。其余7只感染猴均未出现CD4+/CD8+比值倒置（图2）。

图2 SIVmac239静脉感染中国恒河猴外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞比值

Fig.2 The changes of CD4+/CD8+ ratio of T lymphocytes in Chinese-original rhesus macaquesinfected intravenously with SIVmac239

SIVmac239静脉感染恒河猴CD4+ T细胞绝对数

8只SIVmac239静脉感染恒河猴后在感染后CD4+ T细胞绝对数均迅速下降，至感染后11d CD4+ T细胞绝对数下降至最低，随后迅速回弹，再缓慢下降，维持在各自稳定的水平。其中，Rid1感染猴在感染150d后CD4+ T细胞绝对数下降至200个/μL左右，Rid7感染猴在感染154d后CD4+ T细胞绝对数下降至100个/μL左右，两只感染猴的CD4+ T细胞绝对数维持在较低水平（图3）。

图3 SIVmac239静脉感染中国恒河猴外周血CD4+T淋巴细胞绝对数

Fig.3 The CD4+T cell counts (per l blood) in Chinese-origin rhesus macaques infectedintravenously with SIVmac239

1.该模型制备比较成熟，国内外都有此模型，构建和评价指标一致，所以该模型应用广泛，具有统一的操作规程。

2. 该模型制备的关键：1）小鼠必须是重度免疫缺陷的，而且饲养环境必须洁净；2）HIV操作需要生物安全。

3.此模型具有完善的人的免疫系统，HIV感染后，具有艾滋病病人相似的临床症状，所以具有很高的比较医学应用价值。