PDGF-hα-SynucleinA53T转基因帕金森病小鼠模型

一、 PD简介 临床症状主要表现为震颤、肌强直、运动减少、姿势及步态不稳等。 病理表现主要为中脑部位黑质纹状体多巴胺能神经元损害和出现神经元胞浆Lewy小体。发病机制主要包括9种学说，即基因因素，蛋白质错误折叠和聚集，氧化应激反应，神经毒性物质，线粒体缺损，小神经胶质细胞活性，营养因子缺损，基底核排出物过度活跃，细胞程序性死亡。二、 α-Synuclein与PD α-Synuclein基因位于染色体4q21-22，由6个外显子和若干内含子组成，翻译起始密码ATG位于第二号外显子，在第一号外显子有2种不同的拼接位点，因此，转录产生两种不同5’端非翻译序列的α-synuclein cDNA，翻译产物为相对分子质量为19000的蛋白。α-synuclein基因突变, G209A (Ala53Thr)、G80C (Ala30Pro)与家族性PD的发生发展相关。 α-Synuclein蛋白是一种由140个氨基酸组成的高丰度突触前蛋白。仅仅新皮质、海马、嗅球、纹状体和丘脑中广泛表达。α-synuclein蛋白可能与突触前膜功能、神经元的可塑性相关，并动态调节神经传递中囊泡的作用。α-synuclein蛋白是Lewy小体的主要成分之一，α-synuclein蛋白在体内发生聚集导致PD发生的机制和过程尚不明确。

构建带有神经特异性启动子的质粒PDGF-h-α-synuclein-A53T，用显微注射法将线性化转基因质粒注射到C57BL/6J小鼠受精卵中，以C57BL/6J小鼠作假孕受体。

1、基因型鉴定

提取首建鼠后代鼠尾DNA，PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1。

图1. PCR鉴定α-synuclein A53T 转基因小鼠的凝胶电泳分析结果。

1,2,7,11号为α-synuclein A53T 转基因阳性小鼠

2、人α-synuclein 蛋白在SYN-A53T转基因小鼠脑中的表达鉴定

免疫印迹：

提取SYN-A53T阳性转基因小鼠和同窝阴性对照鼠脑组织总蛋白，Western Blot鉴定人α-synuclein蛋白表达，如图2。

图2. Western Blot鉴定人α-synuclein 蛋白在转基因小鼠脑中的表达鉴定。

1、2号甬道为SYN-A53T阳性小鼠，3号甬道为同窝阴性对照小鼠

免疫组化：

10月龄SYN-A53T阳性小鼠及同窝阴性对照小鼠大脑海马区及中脑黑质纹状体区α-synuclein蛋白表达情况，如图3。

图3. α-synuclein免疫组化 （x400）

免疫组化检测α-synuclein蛋白在脑组织中的表达情况。图中左侧为海马区，右侧为黑质纹状体区。A, B为10月龄野生型小鼠脑组织的免疫组化，C, D为10月龄SYN-A53T转基因小鼠脑组织的免疫组化。

3、SYN-A53T转基因阳性小鼠脑部病理表型

酪氨酸羟化酶免疫组化：

为了观察转入的外源性α-synuclein基因异常对小鼠脑组织中酪氨酸羟化酶的影响，用免疫组化检测10月龄α-synuclein A53T转基因阳性小鼠及同窝阴性对照小鼠酪氨酸羟化酶的表达，结果如图4。10月龄人α-synuclein A53T转基因小鼠在黑质纹状体区均出现多巴胺能神经元胞浆内阳性着色，与阴性对照鼠相比并未表现出明显差异。

图4. 酪氨酸羟化酶免疫组化

免疫组化检测酪氨酸羟化酶在脑组织中黑质纹状体区的表达情况。图中左侧为放大100倍，右侧为放大400倍图像。A，B为10月龄野生型小鼠脑组织的免疫组化；G，H为10月龄SYN-A53T转基因小鼠脑组织的免疫组化。

脑苏木素伊红染色：

取10月龄人α-synuclein A53T转基因小鼠及同窝阴性对照小鼠脑组织石蜡切片，HE染色后比较，与阴性对照鼠相比，转基因小鼠神经元及神经胶质细胞大小及形态未见明显差异，结果如图5。

图5. 脑组织HE染色 （x100）

图中左侧为海马区，右侧为黑质纹状体区。A，B为10月龄野生型小鼠脑组织HE染色，G，H为10月龄SYN-A53T转基因小鼠脑组织HE染色 （x100）。

4、SYN-A53T转基因阳性小鼠行为学表现

Rotating rod 实验

取2月，4月和7月龄SYN-A53T转基因小鼠和同窝阴性对照小鼠分别进行Rotating rod实验，发现2月龄开始出现行为改变但尚不明显，4月龄时较阴性对照小鼠表现出协同能力差，运动能力下降，在转棒仪上可停留的时间明显短于对照组小鼠。7月龄时运动能力下降更加明显，与阴性对照鼠相比下降了45.4%。结果如图6。

图6. SYN-A53T转基因小鼠Rotating rod 实验结果

分别取2月，4月和7月龄SYN-A53T及同窝阴性对照鼠，每组12只，测试其可在转棒仪上停留时间。*P<0.05。

本实验采用健康成年SPF级老鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

给予动物鼠笼倾斜、潮湿垫料、高温、噪音、束缚、电击、游泳、昼夜节律颠倒等不同刺激因子，且刺激因子安排为多变性和不可预测，可诱导性是模型制造成功的关键。该模型被广泛用于抑郁症神经生物学机制及抗抑郁药物的研究，以及伴发的焦虑、学习记忆障碍及防护药物研究。

本研究中，通过水迷宫实验、避暗实验结果可以看CUMS模型组水迷宫寻台潜伏期显著性延长，避暗错误次数显著性增加、避暗潜伏期显著性减少等，这些行为学结果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本实验还对CUMS模型的机制进行了基础研究，认为CUMS模型会导致动物皮层的5-HT、DA、Ach、NE等神经递质水平显著性降低（P<0.05）。因此我们认为采用慢性不可预测应激，35天可以造成大鼠和小鼠学习记忆障碍。

模型技术难点在于对于CUMS刺激因子的选择，刺激因子的选择可能影响实验模型的成功与否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、热水游泳(42 °C，5 min)、动物叫声(0.5 h)、束缚(使用自行研发的小鼠行为限制器，长20 cm，直径7 cm)、昼夜颠倒、配对饲养、湿笼、倾笼等。每日选择2~3 种刺激，并尽量使应激程序符合不可预测的特点，以避免动物产生适应性。相同的刺激因子应该隔3-7日再进行。

本研究通过不同的刺激因子对老鼠造成慢性不可预测应激模型，通过水迷宫、避暗等经典行为学指标，以及5-HT、DA、Ach、NE等神经递质基础机制指标，表明了慢性不可预测应激诱导老鼠学习记忆损伤模型的成功，并且该模型对于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于进一步的改善学习记忆药物的药效学评价。