SIVmac251阴道途径感染恒河猴模型

一、 艾滋病概述

艾滋病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiency Virus, HIV）引起，以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病，是20世纪危害人类健康和生命最严重的病毒性疾病之一。自美国CDC报道首例艾滋病后，到20世纪80年代中期艾滋病发展成为一个性的流行病。截止2014年底，HIV已感染3690万人，2014年新增感染者200万，2014年因艾滋病死亡120万人。艾滋病在1985年传入我国，截至2015年5月31日，历年累计报告艾滋病530628例，其中艾滋病病人217457例，死亡167159例。艾滋病早已成为关注的公共卫生和社会热点问题，艾滋病的预防与治疗也成为当代生物医学研究的前沿热点之一。

二、艾滋病动物模型简介

艾滋病发病机制研、药物和疫苗的保护性研究及评价等方面在很大程度上依赖理想的动物模型。人们发现HIV以后，用HIV感染过多种动物，但由于种种原因，结果并不理想。研究发现猴免疫缺陷病毒(SIV)感染实验用猴的模型效果比较理想，表现为和AIDS的临床表征，发病过程、免疫缺陷特征等非常相似，加之HIV和SIV有一定的基因同源性，人和猴的生物学特性也较其他动物接近，因而，SIV/SAIDS(猴艾滋病)模型被广泛接受和应用。

SIV是猴获得性免疫缺陷综合征（SimianImmune Deficiency Syndrome，SAIDS）的主要致病病毒，为典型的C型病毒粒子，基因组长度大约为9.2kb，基因组成同HIV-1和HIV-2基本相同，其完整的原病毒基因含有二个LTR以及同HIV类似的基因：gag、pol、vif、tat、rev、env和nef。所有基因在SIV的排列顺序同HIV完全一样。目前国内外对SIV的研究多集中在非克隆株SIVmac251和克隆株SIVmac239上，因为这两个病毒株能在多种猕猴属动物身上引发致死性免疫缺陷综合征，同时伴有CD4+淋巴细胞下降，继发机会性感染病毒性脑膜脑病。这些都与人类AIDS类似。

艾滋病的三种传播途径分别是经血液、性和母婴传播，性传播包括同性传播和异性传播两种方式。艾滋病动物模型的制备首先要考虑其实际应用价值，最好的动物模型可以最大限度的模拟人类疾病，包括使用与自然感染相同或接近的方式建立模型。为模拟异性间性传播的感染方式，通过阴道粘膜上皮途径接种病毒，病毒可能直接感染郎格汉斯细胞、上皮细胞等。在灵长类动物AIDS模型的研究中发现体内注入黄体酮可促进SIV/SHIV传播，而雌激素则抑制SIV/SHIV传播，可能与这些激素能影响阴道壁厚度或通过IL-2等影响CCR5和CXCR4受体表达有关。在合适的生理周期或使用一定量的黄体酮的情况下，用导尿管将病毒缓慢注入猴阴道内，可建立异性性传播动物模型。

1、 实验用病毒：感染毒株为SIVmac251中国恒河猴细胞适应株，病毒原液TCID50为2×107/mL。

2、 感染动物：选用体重4-6kg的SPF恒河猴。实验前体检无异常，必须排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相关的4种基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）筛查结果为阴性。所有感染动物必须在ABSL-3室中进行。

3、 感染方法：将麻醉好的实验猴放在操作台上，动物采取俯卧位，后肢抬高，暴露阴道口。用2mL预冷的无菌PBS清洗阴道。再将1mLSIVmac251病毒原液缓慢推入。实验猴保持此姿势30min。

4、 SIVmac251阴道感染猴样品采集和指标测定：在感染前和感染后3、7、10、14、17、21、28、42、56天采集EDTA抗凝血4mL，分别测定血浆病毒载量、CD4+/CD8+比值及血浆抗体测定。

5、 SIVmac251阴道感染猴血浆病毒载量的测定：提取EDTA抗凝血浆中病毒RNA，使用SYBR Green I 实时荧光定量RT-PCR方法测定血浆病毒载量。

6、 SIVmac251阴道感染猴外周血CD4+/CD8+比值测定：CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE抗体标记EDTA抗凝全血淋巴细胞，流式细胞仪测定CD4+/CD8+比值。

7、 SIVmac251阴道感染猴血浆抗体测定：免疫荧光法（IFA）检测感染猴血浆中的抗体水平。

1、 临床症状

实验猴在感染后14天出现食欲减退，并持续两周左右，体重有所下降，有浅表淋巴结肿大。

2、 SIVmac251阴道感染恒河猴外周血病毒载量结果

S142猴经SIVmac251阴道感染后10d检出病毒载量阳性，之后迅速上升，在14d达到高峰，峰值为6.48×107，随后迅速下降（图1）。分别经三种不同途径（静脉途径、直肠途径和阴道途径）感染的实验猴在SIVmac251感染后血浆病毒载量的变化趋势基本一致，但病毒检出时间稍有不同，首先是静脉感染猴S153在3d检出阳性，其次为直肠感染猴S172在7d检出阳性，最后是阴道感染猴S142在10d检出阳性。

图1 SIVmac251不同途径感染恒河猴血浆病毒载量结果

Fig.1 Viral load in plasma of SIVmac251-inoculated rhesus monkeys bydifferent route

1、 SIVmac251阴道感染恒河猴外周血CD4+/CD8+比值结果

S142猴经SIVmac251阴道感染后CD4+/CD8+比值持续下降到第7d开始回升，到第10d时出现一个反弹峰，随后CD4+/CD8比值又继续下降，直到28天时下降到最低点，发生比例倒置。在急性期，S142猴的CD4+/CD8+比值一直在1以下波动。（图2）。三只不同途径感染的实验猴CD4+/CD8+变化趋势基本保持一致，S172（直肠感染猴）和S142（阴道感染猴）倒置的比S153（静脉感染猴）严重。

图2 SIVmac251不同途径感染恒河猴CD4+/CD8+比值

Fig.2 CD4+/CD8+ ratio of SIVmac251-inoculated rhesus by different route

1、 SIVmac251阴道感染恒河猴血浆抗体检测结果

S142猴经SIVmac251阴道感染后在第14d时血浆抗体均转为阳性，在21d时血浆抗体滴度缓慢上升，到42d时开始急剧上升，直到第56d，血浆抗体最高到1:640（图3）。静脉感染猴S153在第10d时最早检出阳性，随后抗体滴度平缓上升，直到第56d；直肠感染猴S172在第14d时血浆抗体均转为阳性，在21d时S172血浆抗体滴度迅速上升，42d时S172开始急剧上升，直到第56d，S172最高到1:1280。

图3 SIVmac251不同途径感染恒河猴血浆抗体检测结果

Fig.3 The result of antibody in plasma after SIVmac251inoculate rhesus by different route

1.该模型制备比较成熟，国内外都有此模型，构建和评价指标一致，所以该模型应用广泛，具有统一的操作规程。

2. 该模型制备的关键：1）小鼠必须是重度免疫缺陷的，而且饲养环境必须洁净；2）HIV操作需要生物安全。

3.此模型具有完善的人的免疫系统，HIV感染后，具有艾滋病病人相似的临床症状，所以具有很高的比较医学应用价值。