土拨鼠肝炎病毒cWHV7P1颈部皮下感染土拨鼠模型

一、疾病概述

土拨鼠WHV感染模型是重要的HBV替代感染动物模型。土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus，WHV）属于嗜肝病毒科（Hepadnaviridae）、正嗜肝病毒属（Orthohepadnavirus），是继人类乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）之后发现的另一个嗜肝DNA病毒。各种嗜肝病毒在病毒基因组结构、基因组复制周期、病毒蛋白的序列、病毒颗粒的结构和在自然宿主体内自然感染的过程等方面都很相似， WHV与HBV的基因同源性相对较高，约为62%-70%；而且土拨鼠感染WHV后易转为慢性感染，且通常表现为活动性慢性肝炎，在感染后2年，约有50%动物进展为肝细胞肝癌。因此，WHV感染模型是研究人类HBV的重要的动物模型。

WHV的受体以及其进入肝细胞的机制目前都尚未确定。在WHV感染的土拨鼠后，WHV DNA基因组进入肝细胞核，通过内源性逆转录DNA聚合酶形成部分DNA链，然后再形成完整的双链cccDNA。cccDNA 作为关键模板在RNA聚合酶II作用下合成mRNA。一部分病毒mRNA（稍大于基因组转录长度）壳体化与病毒聚合酶一起进入成熟的核粒子，并通过RNA依赖的DNA聚合酶合成病毒DNA负链。然后，病毒聚合酶利用其DNA依赖的DNA聚合酶完成约50%-75%的DNA正链，这些非cccDNA存在于成熟WHV中。成熟的病毒颗粒在粗面内质网安装，并由肝细胞分泌排出。

成年土拨鼠感染WHV病毒，大部分会发生自愈，只有约5%发展为慢性肝炎。在成年土拨鼠急性感染期间，一直用环孢素A暂时抑制细胞免疫，则可导致92%的感染土拨鼠发展为慢性携带者。若仅在接种期和急性感染的早期（0-4周）注射环孢素A，则只有50%的感染动物发展为慢性携带者。绝大多数WHV慢性感染来源于新生土拨鼠的获得性感染。新生土拨鼠感染WHV病毒后，有60%-70%概率发展为慢性肝炎病毒携带者，只有25%-40%的几率能自行恢复。慢性WHV感染会导致长期的病毒复制，从而导致慢性肝病或肝癌，这一点与人的乙肝感染极为类似。一般来说，慢性WHV感染土拨鼠体内存在大量的病毒复制，具有较高水平的表面抗原和e抗原；在此期间，病毒保持对宿主的免疫耐受是从慢性肝病发展到肝癌的重要因素。

土拨鼠肝炎感染模型相比其他HBV肝炎模型具有独特的优势：首先土拨鼠属于啮齿类动物，相对灵长类，在实验动物伦理方面存在的问题比较少。其次，土拨鼠一胎多仔，在实验动物繁殖来源方面也具有很大的优势。最重要的是由于土拨鼠肝炎病毒WHV与HBV的基因同源性相对较高，当WHV感染土拨鼠之后，其感染过程与免疫病理反应，与人感染HBV极其相似；从而使土拨鼠肝炎模型的研究结果在国际上具有一定的可信度，也经常应用于HBV药物疫苗效用评价的研究。

二、模型背景

1、WHV病毒信息

土拨鼠肝炎病毒（WHV）属于正嗜肝DNA病毒属，同HBV病毒一样，WHV病毒是一类双链DNA反转录病毒，病毒颗粒由脂质双层和蛋白构成的外衣壳包被，其含有病毒表面抗原WHsAg；内部核心包含内衣壳与其包裹的DNA，内衣壳含有核心抗原。DNA为WHV病毒的遗传物质，呈有缺口的环状结构，功能是编码表面抗原、核心抗原和DNA多聚酶。cWHV7P1亚型是感染效率比较高的WHV病毒亚型，是实验室常用的土拨鼠感染病毒。

2、土拨鼠背景信息

土拨鼠（woodchuck）即指美洲旱獭（Marmota monax），属于啮齿类松鼠科地松鼠属，在人工饲养条件下，可存活9~14年。

形体特征：体短身粗，无颈，四肢短粗，尾、耳皆短，头骨粗壮，眶间部宽而低平，眶上突发达，骨脊高起，身体各部肌腱发达有力。体毛短而粗。臼齿（包括前臼齿）在颌的两侧各为5/4，上臼齿5枚，前后肢间无皮翼。成年土拨鼠：体型较大，平均体长40到60厘米，重2-4公斤，毛色棕褐色。出生3日龄乳鼠：无被毛，呈红褐色，体重60-80g。

生活习性：白天活动，食量大，耐饥饿，不饮水，喜食含水量大的多汁饲料。易驯化，不伤人，不耐热，抗病力强。

繁殖方式：幼体3岁时达到性成熟，一年繁殖一次，一胎多仔；相较于非人灵长类实验动物在繁殖方面具有很大的优势。

3、研究背景

自从1978年土拨鼠肝炎病毒被发现以来，该病毒及其宿主土拨鼠一直是研究和应用于人类乙肝病毒感染的最适合的模型。1978年，Summers J.等人首次报道了WHV（A virus similar to human hepatitis B virus associated withhepatitis and hepatoma in woodchucks. Proc. Natl. Acad. Sci. 75(9): 4533-4537.）；此后，Korba B.E.等于1989年报道了WHV可引起慢性感染土拨鼠进展成肝细胞癌（Hepatocellular carcinomain woodchuck hepatitis virus-infected woodchucks: presence of viral DNA in tumortissue from chronic carriers and animals serologically recovered from acuteinfections. Hepatology. 9(3):461-70.）。CoteP.J.在2000年发表的文章中对于影响WHV慢性感染模型成功建立的重要因素进行了试验，确定三日龄土拨鼠乳鼠、以及5X106 WID50 WHV的感染剂量可成功获得土拨鼠慢性肝炎模型（Effects of age and viraldeterminants on chronicity as an outcome of experimental woodchuck hepatitisvirus infection. Hepatology 31(1):190-200.）。WHV与人病毒关系密切，在形态、基因组结构和基因产物、复制、流行病学、感染过程以及疾病和肝细胞癌的发展等方面都有很强的相似性。由于这种高度同源性，土拨鼠模型被用于开发新疫苗、治疗性疫苗和抗病毒药物的许多研究。此外，土拨鼠系统还用于研究病毒生命周期的分子机制、致癌机制和细胞感染机制。

3日龄土拨鼠，颈后皮下注射100μl 5X106 WID50 WHV(cWHV7P1)，感染后定期检测血液中病毒载量，并检测血清肝功生化水平（包括ALT、AST、GGT等）；12个月后能检测到血清中WHV病毒载量在1x104copies/ml以上，肝脏病理有炎症，可判定慢性肝炎模型建立。

1. 实验前准备：（1）实验环境：WHV病毒具有种属特异性，只感染土拨鼠，不感染人和其他实验动物；且未出现在《人间传染的病原微生物名录》中。动物感染病毒和饲养都可在普通环境中进行，但需跟土拨鼠繁殖区分开。

（2）实验动物：土拨鼠即指美洲旱獭（Marmota monax），属于啮齿类松鼠科地松鼠属；本实验动物来源于中国医学科学院医学实验动物研究所北方资源中心，饲养于普通环境，感染实验前排除WHV等烈性病原体的感染。选取更易形成WHV慢性感染的3日龄土拨鼠乳鼠，用于土拨鼠肝炎模型的感染实验。

（3）WHV病毒毒株：cWHV7P1，GenBank：M18752.1，储液浓度5X107 WID50，

2. 实验步骤：（1）WHV病毒感染剂量：感染所用剂量为100μl 5X106 WID50。感染前，在生物安全柜中，用生理盐水将病毒储液稀释至5X106 WID50，稀释后注意低温保存，现配现用，避免反复冻融；（2）感染途径：颈后皮下注射感染，采用单手背部抓取固定的限制方法3日龄乳鼠，注射100ul病毒（5X106 WID50）至颈后皮下。感染完成后观察是否有病毒从注射处漏出，若漏出量大则需弃去该实验动物。

[注意事项] 抓取固定乳鼠：3日龄乳鼠没有太大的爬行力，抓取时用左手拇指和食指抓住乳鼠颈部皮肤，用手掌轻压动物身体加以固定。

[注意事项] 颈后皮下注射：皮下注射会形成鼓包，需注意有病毒从注射处漏出；在注射后注意观察病毒的吸收情况。

1、病毒检测：

在急性感染期，WHV病毒在血液中的水平在感染后5-6个月达到峰值，平均载量约为107copies/ml，而在6~12个月维持比较低水平（103~4copies/ml）的复制（图1A）。由于机体无法清除病毒，WHV在肝脏中长期复制，在血液中能持续检测到病毒核酸；在慢性感染的前期和中后期，病毒在血液中的水平大部分时间维持在104copies/ml（图2A，3A）；

图1. 土拨鼠感染WHV病毒急性期病毒载量和生化指标变化情况。A. 急性期病毒载量情况；B. 急性期生化指标情况。

图2. 土拨鼠感染WHV病毒慢性感染期病毒载量和生化指标变化情况。A. 慢性期病毒载量情况；B. 慢性期生化指标情况。

图3. 土拨鼠感染WHV病毒慢性感染中后期病毒载量和生化指标变化情况。A. 慢性感染中后期病毒载量情况；B. 慢性感染中后期生化指标情况。

2、临床表型：血清学指标检测

为了评价感染动物肝脏是否病变，可检测感染动物血清肝功指标的变化情况。在感染急性期，谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的水平都有短暂的升高，但与正常对照没有显著性差异（图1B）。在慢性感染前和中后期，部分动物的AST的水平明显升高（图2B，图3B）。作为病毒性肝炎和肝癌的标志分子γ-谷氨酰转肽酶（GGT）在感染动物中普遍有轻度升高（图1B，图2B，图3B）。

3、病理表型:

在检测感染动物肝脏病理变化时，能明显观察到慢性炎症表型。图4为6号和10号动物在感染慢性期的肝脏病理结果（HE染色）：肝窦扩张，可见大量炎细胞弥漫浸润；肝细胞及肝窦巨噬细胞内可见棕黄色素。

图4. 土拨鼠感染WHV病毒慢性感染期病理变化情况。A-C. 6号动物慢性感染期病理表现；D-E. 10号动物慢性感染期病理表现。（HE染色）

WHV病毒具有种属特异性，只感染土拨鼠，不感染人和其他实验动物；且未出现在《人间传染的病原微生物名录》中。动物感染病毒和饲养都可在普通环境中进行，但需跟土拨鼠繁殖区分开。WHV病毒已经过风险评估，具有相应标准操作程序。模型实验已得到IACUC批准，获得实验资质。

WHV病毒只对土拨鼠敏感，并不感染人、以及小鼠大鼠等常用的实验动物；在土拨鼠种群中常为垂直感染模式，实验室中采用的为血液感染模式。为预防对其他土拨鼠的影响，实验人员均需经过生物安全培训获得证书，具有生物安全操作资质；进入动物房之前，穿戴防护服、口罩、帽子、鞋套等进行防护；实验结束后按要求去除防护设备集中处理。尽量避免进入感染动物区后再进入繁殖区，若需进入则应更换整套个人防护设备。

由于感染WHV土拨鼠血液中可能存在着大量病毒，因此对于采血后的耗材、以及沾染到血液的垫料等，都需要进行高压灭菌处理，以消除正常土拨鼠的潜在感染源。动物感染病毒后取得的血液和组织直接放入核酸裂解液或组织固定液，灭活病毒。所有涉及到的相关污染物如离心管、灌胃针、手术剪、手术镊和毒株等将统一高温高压消毒后集中处理。

动物实验操作均在ABSL-2动物房的生物安全柜中进行，实验后将病毒毒株、动物尸体、尿垫等包装好进行高压灭菌处理，注射器放入利器桶处理。

（一）模型评价方法：

1. 临床症状观察：

血清中肝功生化指标的两种转氨酶（ALT，AST）是肝损伤的重要标志物，GGT的变化除了能表明肝炎急性期和慢性期的情况，同时对于肝脏肿瘤也具有一定的指示作用。这些指标可通过常规血清检测得到数据。

2. 病毒载量测定方法：

（1）WHV病毒DNA的提取：

血清样本处理：用促凝采血管收集的血样，室温放置30min后，3000rpm室温离心10min，得到上层血清放入离心管中备用；组织样本处理：检测WHV病毒载量主要组织样本为肝脏，分别在每个肝叶取约50mg样本，用生理盐水漂洗后，加入到含蛋白酶K的DNA裂解液中，裂解16h至组织破碎完全。使用DNA提取试剂盒提取病毒DNA，最后用30μl水溶解DNA。短期保存可存放于4℃冰箱，若需长期保存需存放于-20℃冰箱。

（2）WHV病毒载量的测定：实时荧光定量PCR方法

实验前准备：DNA样品制备：待测样本：待检测的感染WHV病毒的土拨鼠血清，按照5.2.1所用方法提取WHV病毒DNA；标准品：已知浓度的WHV-DNA质粒，按照109、108、107、106、105、104、103copies/μl进行稀释；空白对照：分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)；阴性对照：未感染WHV病毒的土拨鼠血清；

实验步骤：（a）每个待检测样本反应液的组成为：

2×SYBRAdvantage qPCR Premix 10 ul primer-forward（20μM）1 ul primer-reverse（40μM）1 ul TemplateDNA 2 ul Total 20 ul

WHVprimer: Forward primer 5'-TCTCCTGGACTGGAAAGGTT-3'

Reverseprimer5'-ATTGAGCCAAGAGAAACGGG-3'

（b）扩增条件设定：

（3）仪器检测通道选择：

使用ABIStepOne Plus荧光PCR检测仪时选择SYBR Green荧光信号，收集设在58℃。具体设置方法请参照各仪器使用说明书。

（4）结果分析阈值设定：

使用ABIStepOne Plus荧光PCR检测仪进行结果分析，基线和阈值设定根据仪器噪音情况调整。

（5） 荧光定量PCR反应系统的质量控制：

a. 反应结果应同时符合以下条件，否则实验结果无效。

阴性对照：无扩增，为阴性。

标准品：CT值＜28

否则结果无效。

b. 结果判断：

阴性：无CT值或CT值大于38

阳性：CT值＜38，可报告为阳性。

CT值大于38的样本建议重做，若重做结果CT值＜38，该样本判断为阳性，否则为阴性。

阳性样本具体载量根据标准曲线进行计算。

图5. 荧光定量PCR实验的扩增曲线和标准曲线

3. 病理分析：HE染色

组织样本经固定、包埋、切片处理后，可通过H&E染色观察感染动物组织内的损伤情况和炎性细胞的浸润状况。具体步骤如下：

用10%福尔马林固定72h，在24h内可换液一次；将固定的组织修块后脱水、透蜡用石蜡包埋；随后石蜡块进行切片；石蜡切片脱蜡后，进行苏木精染色；切片继续脱水后染伊红；最后进行透明、封片，得到HE病理切片，可进行镜检。标本切片可长期保存。

（二）评价指标：

1. 临床症状评价：

由于免疫系统未发育完全，新生土拨鼠感染WHV病毒后，有60%-70%的概率发展成慢性感染。在感染急性期，肝功生化指标（ALT和AST）都有升高，表现出肝脏损伤；而长期的病毒复制导致慢性肝炎，期间虽然血液中检测的病毒载量会有波动，但肝部损伤加剧，且肝脏炎症和肿瘤标志物指标升高。

2. 病毒复制情况评价体系：

在急性感染期，WHV病毒在血液中的水平在感染后5-6个月达到峰值，平均载量约为107copies/ml。此后由于机体无法清除病毒，WHV在肝脏中长期复制，在血液中能持续检测到病毒核酸，病毒在血液中的水平大部分时间维持在104copies/ml。

3. 病理评价体系：

WHV病毒感染土拨鼠，在慢性期肝脏病理发生显著变化，可观察到慢性炎症表型，包括：肝窦扩张，大量炎细胞弥漫浸润等。