氧嗪酸钾致急性高尿酸血症小鼠模型

尿酸是嘌呤在人体中代谢的最终产物，主要通过黄嘌呤脱氢酶/氧化酶（XDH / XO）在肝脏中产生，并通过肾脏排泄。高尿酸血症（HUA）的特征是血液中尿酸水平升高。痛风是一种由于细胞外尿酸盐过饱和而在关节和其他组织中沉积尿酸钠盐晶体而引起的疾病。 HUA定义为血液中饱和的血清尿酸盐浓度（>7.0 mg / dl，等于416.5 µmol / l）。痛风和HUA在人类中的发病率近来一直在增加。HUA也与高血压和代谢综合征的发病机制有关。根据临床报告，关键的病因是尿酸，不仅与痛风的风险增加有关，而且与心血管疾病，肾结石，糖尿病，肥胖和血脂异常的风险增加有关。

黄嘌呤氧化酶主要存在于肝脏和肠道中，可将次黄嘌呤氧化成黄嘌呤，黄嘌呤氧化成尿酸。尿酸是嘌呤代谢的副产物，正常情况下，尿酸由肾脏排泄; 然而，如果由于尿酸过量或肾功能不全而未能通过泌尿系统完全清除，过量的尿酸会结晶沉积在关节和肾脏中，导致痛风的发展，痛风是世界范围内常见的疾病。由于啮齿类动物体内有尿酸酶，尿酸酶能够催化尿酸氧化生成尿囊素、过氧化氢和二氧化碳，所以，对于高尿酸血症啮齿类动物模型，抑制尿酸酶活性是造模的关键。氧嗪酸钾是一种竞争性尿酸酶抑制剂，可阻断肝脏尿酸酶的作用，并在啮齿类动物中产生尿酸，氧嗪酸钾是合适的造模用药。

1. 诱导剂准备

氧嗪酸钾，Sigma公司产品，纯度≥97%。溶于羧甲基纤维素钠，制备成100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg / kg 和 600mg / kg 剂量。

2. 实验动物

SPF级ICＲ小鼠160只，雌雄各半，18~22g,饲养于屏障环境。

3. 给药

对照组腹腔注射 1%CMC-Na，实验组给药方案分别如下: 600mg / kg 剂量氧嗪酸钾组、47.2mg/kg 剂量别嘌醇组、600mg/kg 氧嗪酸钾 + 47.2mg/kg别嘌醇组600mg/kg 氧嗪酸钾 + 6.3mg/kg 别嘌醇组。

4. 模型分析指标

（1） 尿酸水平检测

给药后1h、2h、4h、8h 空腹割尾采血 0.4ml于1.5ml EP 管中，置于4℃ 冰箱放置1h，4℃ 、13 000r/min 离心15min，取血清，磷钨酸法测定尿酸值。

（2） 小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶 / 脱氢酶 (XDH / XO) mＲNA表达水平检测

8小时后处死小鼠，取肝脏，提取RNA，逆转录为cDNA,设计引物F:5 ＇-TGATGCAAGCTGGTGGTG-3＇;R:5＇-GCCACTGAGGTCAGTTCAAGGA-3＇实时荧光定量法检测: 首先将小鼠肝脏 c DNA 以 10为稀释因子，做 5 个梯度稀释，然后分别做 XDH/XO 基因及 GAPDH 基因的标准曲线，再根据标准曲线的扩增效率对基因的表达效率进行检测。具体操作方法如下: 分别加 XDH/XO 基因及 GAPDH 基因上、下游引物各 1μL( 10p) ，再分别加 SYBＲ Premix Ex Taq II ( Tli ＲNase H Plus) 12．5μL 及灭菌去离子水 9． 5μL、c DNA 1μL，总体积 25μL，实时荧光定量 PCＲ 设无模板对照反应条件为: 94℃ 预变性 30s，94℃变性 5s、59℃ 退火 30s、40 个循环，其中 59℃ 到 94℃ 每 5s 采集一次荧光。反应完成后根据荧光信号的数据，使用 CFXManager软件计算出 XDH/XO mＲNA 表达的差异。

1. 血清尿酸水平变化

给药后 1h，氧嗪酸钾各剂量组的血清尿酸值都开始升高，其中 200mg/kg、300mg/kg 以及 600mg/kg 氧嗪酸钾剂量组与对照组比较显著增高。造模后 2h 只有 600mg/kg 氧嗪酸钾剂量组血清尿酸值继续升高到( 432 ± 34) μmol/L，其它各组血清尿酸值均已下降，600mg/kg 氧嗪酸钾剂量组血清尿酸值在药后 4h也开始下降到和正常对照组一般的水平（表1）。

2. 黄嘌呤氧化酶表达变化

小鼠鼠腹腔注射 600mg/kg 剂量的氧嗪酸钾组，肝脏组织 XDH/XOmＲNA 表达较对照组上调; 同时注射 600mg / kg 剂量氧嗪酸钾、47． 2mg / kg 和 3mg / kg 剂量的别嘌醇组，肝脏组织 XDH / XOmＲ-NA 表达较模型组 600mg / kg 剂量的氧嗪酸钾组下调，差异不明显，注射 47． 2mg/kg 和 Blank 组( 未做任何给药处理的组) 与1% CMC-Na 组 XDH / XOmＲNA 相当（表2）。

模型动物饲养在武汉大学人民医院动物房SPF级动物实验室，实验动物使用许可证SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特点

门采用专用净化密闭门并配备观察窗。单向走道呈顺时针走向设计。屏障系统内共有大鼠饲养室1间，小鼠饲养室3间，隔离观察室1间，实验准备室1间，洁物存放室1间，清洗消毒室1间。此外，屏障系统外配有监控室、机房和配电室等。

（2）设计参数

室内温度：20～26°C；日温差：≤4°C；相对湿度：40%～70%；换气次数：15～20次/h；气流速度：≤0．2m/s；压强梯度：20～50Pa；空气洁净度：7级；菌落数：≤3个/皿；氨浓度：≤14mg/m3；噪声：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；动物照度：15～20lx；昼夜明暗交替时间：12/12h。

（3）通风和空调系统

动物实验室采用全新风中央空调通风系统。空气经过初、中、三级过滤器后进入实验室内环境。

（4）照明系统

一更、淋浴、二更、气闸、清洁走道、洁物存放处、污物走道、缓冲间和清洗消毒间、动物饲养室、实验准备间、隔离观察室和功能实验室等安装有手动和自动开关，根据实际需要，调节控制室内照明灯。未启用房间、清洁走道、洁物存放处、污物走道等在每日中午12点和晚上8点开启紫外线灯照射1h。

（5）通讯系统

因为SPF级动物实验室的环境和设施具有特殊要求，人员进入后不能随意出入，而室内外的联系又十分重要，故室内各房间均安装内部电话机，按照房间顺序编排电话号码，各室内电话可相互连通，并均与监控室总机保持联系，保证实验室内外信息的及时沟通。

（6）监控系统

对SPF级动物实验室的出入口、走道、实验动物饲养室、功能操作室等重要位置均安装了可作270°旋转的摄像机，能够及时了解设施的运行状态；也能有效督促实验人员执行科学的操作规程，避免人为因素造成室内环境和设施的污染；并对整个实验期间的动物状态和反应进行观察，减少对动物的滋扰。

（7）供水系统

SPF级实验动物饮用水以纯净水为宜。本实验室采用管道供水，将处理后的纯净水用塑胶管道输送到屏障系统内实验准备室，设置接水槽，为实验动物供应灭菌的饮用水和屏障系统内用水。要经常更换和清洗输水管道，清洗笼具的用水添加适当比例的84消毒液。

（8）供电系统、警报系统和消防设施

SPF级动物实验室要求全天候不间断供风和供电，如果出现故障，不能及时发现和处理，就可能导致环境设施的污染、动物感染或死亡，造成严重后果。因此应对SPF级动物实验室使用独立稳定的供电系统，并配备有应急电源。在中央空调机房控制室安装风机故障警报系统，以便及时检修和维护，保证设施的安全运行。

（9）消毒灭菌设备

为防止外界物品进入SPF级动物实验室时所携带的细菌污染室内环境和造成动物交叉感染，按照不同物品的特性，进行紫外线照射消毒、渡槽消毒液消毒或专用的机动门真空灭菌器消毒。

（10）动物饲养笼具

饲养大、小鼠的笼具聚碳酸脂材料的塑胶笼具，具有高透明、耐高压、耐高温、耐酸碱等特点。通用的不锈钢笼具长、宽、高分别为40、30、20cm，适用于单笼饲养有特殊要求的实验动物，配有底盘和食槽，确保实验动物有充足的采食和活动空间，同时也保证室内环境的清洁。

（11）垫料的选择和使用

在使用塑胶垫料时，垫料是大小鼠直接接触的铺垫物，起到吸湿、保暖和造窝的作用。垫料的好坏直接影响到大小鼠术后的恢复、生长发育和繁殖性能。目前，所使用的垫料主要有玉米秸垫料、刨花垫料。

（12）饲料配制

大小鼠的生产型饲料和维持型饲料必须严格按照国家标准，进行科学配制生产。每半年检测一次饲料的微生物指标和有效营养成分指标，保证饲料的质量。

该模型通过长期观察普通狼疮小鼠模型，待其到40周龄时，检测其dsDNA等，结合皮肤症状变化，来确定慢性狼疮皮肤病模型的建立。目前国际上尚欠缺类似模型，为研究狼疮皮肤病发病机制提供了工具。