CCL4诱导小鼠肝脏纤维化模型

肝纤维化是一个病理生理过程，是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生。任何肝脏损伤在肝脏修复愈合的过程中都有肝纤维化的过程，如果损伤因素长期不能去除，纤维化的过程长期持续就会发展成肝硬化。临床症状常见疲乏无力、食欲减退、慢性消化不良、出血等。治疗主要是针对原发病的病因治疗。病因多见于病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性疾病等。

四氯化碳动物模型是目前应用于抗肝损伤和纤维化药物评估的主要研究模型。其作用机制为：在肝细胞内质网中，四氯化碳被肝微粒体细胞色素P450氧化酶激活后生成三氯化碳，与肝细胞内大分子发生共价结合，破坏肝细胞功能。此外，还可攻击肝细胞膜的磷脂，引起脂质过氧化破坏膜性结构，损伤肝细胞。

1.C57小鼠，

品系来源 ：1)遗传背景及亚系:1921年Ltle用 Abbg Lathrop的小鼠株雌鼠57号与雄鼠52号交配，而得C57BL6。亚系:C57BL6、C57B/6、C57BL/6N等。 (2)毛色基因标记：aa、BB、CC（黑色）

(3)主要遗传学特征：a免疫学特征：一般饲养条件下免疫球蛋白的量随年龄而增加，而到生后20个月时则1gG增长缓慢，无菌饲养的绝对量较低。IgM水平较高，出生12月以后，有的个体超过80ug/mL。无菌饲养的动物lgM量比一般饲养的高。细胞免疫低下者少见，这可能与自发肿瘤少有关。b。形态学特征：在新生鼠中，雌鼠为16.8%，雄鼠3%为小眼或无眼症。0.6%后肢可见多趾症，另外水头症占2%~4%，耳头症占0.4%，交合不全占3%。c生理学特性：有强嗜酒精性。对放射性照射为中等强度感应度，LD50为630+4R，将雄鼠皮肤移植到同系的雌鼠身上，约20日被排斥掉，这是因为在组织相容性抗原中的雄抗原在C57BL中非常显著。d癌发生率：乳癌发生率低,不足1%，白血病为7%-16%化学致癌成功率低，放射性照射较容易诱发肝癌。

2.肝纤维化对照小鼠：C57 小鼠 ，名称：C57。

3.诱导方法：腹腔注射CCl4的油剂溶液（50 ul/10g体重，CCl4：橄榄油=1:9），每周注射三次，隔一天一次，连续注射4-6周，每周称重一次，实验结束前，禁食4小时，取血液测量血生化等指标，取肝脏进行称重，病理及相关蛋白分析。

一、肝脏大体形态变化

腹腔注射CCl4的油剂溶液（50ul/10g体重，CCl4：橄榄油=1:9），每周注射三次，隔一天一次，连续注射4周，取肝脏组织。

图1肝脏大体形态

二、肝脏纤维化指标检测

腹腔注射CCl4的油剂溶液（50ul/10g体重，CCl4：橄榄油=1:9），每周注射三次，隔一天一次，连续注射4周，取肝脏组织行Western Blot检测肝纤维化相关蛋白

图2 肝脏组织纤维化相关蛋白表达情况

三、肝脏马松染色

腹腔注射CCl4的油剂溶液（50ul/10g体重，CCl4：橄榄油=1:9），每周注射三次，隔一天一次，连续注射4周，取肝脏组织，10%福尔马林固定，制成石蜡切片行马松染色。

图3 肝脏组织马松染色

本实验采用昆明种6-8周龄的健康成年小鼠，体重均在33±2g，SPF级。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京斯贝福生物科技股份有限公司，动物用水为实验室制UP水经过除菌处理。饲养及实验操作均于具有检验合格资质的SPF级屏障动物室内进行，并且实验动物以完整的包装直接进入屏障实验室，观察室适应7天后无异常情况，方可进行实验。所有实验中小鼠均引颈处死，尽量减少动物手术创伤程度及失血量。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

1. 该模型鉴定和评价的技术方法和指标体系，符合溃疡性结肠炎的病理特点，尤其与溃疡性结肠炎反复发作、迁延不愈的临床特点高度相似。

（1） 疾病活动指数

（2） 结肠指数

（3） 结肠组织大体评分

（4） HE 染色病理观察

（5） MPO 酶活性检测

2. 与国内外现有模型的异同

现有的溃疡性结肠炎的造模方法有单一化学法刺激、免疫法、免疫复合法、基因修饰法。虽然现在建造UC动物模型的方法多种多样，但是依旧存在着或多或少的缺陷。理想模型要简单易操作，同时尽可能全面、准确的模拟人类UC的病理生理学特点和表现，既要与自发的炎症诱因相近，又要符合肠道炎症进展、组织损伤进展等，同时模型病变尽量维持较长时间，能尽量反映慢性病变的过程和特点，以满足实验的需求。而目前尚缺乏能满足这些要求的模型，且已有模型以急性损伤模型为主。故亟待寻找更好的，具有良好重复性、稳定性，并且操作简单的动物模型，从而为研究UC发病机制、研发治疗新药物提供良好的基础。

3. 本研究的主要创新点或技术关键

3.1 创新点

本模型采用诱导剂联用的方法，建立慢性、炎症维持时间长且病程稳定的小鼠慢性 UC 造模方法。该模型改进了传统溃疡性结肠炎模型的病程短、稳定性差、模型指标缺少特异性等问题，更大程度的模拟了临床慢性溃疡性结肠炎病理指标。

3.2 关键技术

采用噁唑酮和2,4,6-三硝基苯磺酸两种诱导剂联用、致敏与感染相结合的方法，建立了新慢性、炎症维持时间长且病程稳定的小鼠慢性 UC 模型方法。

4. 可行性分析

4.1 前期摸索研究充分，通过阅读大量中外文献，较充分的了解溃疡性结肠炎疾病以及模型建立过程中的问题。

4.2 实验单位具备动物饲养许可证以及较先进的实验器材和检测设备。

4.3 通过阅读大量中外文献和走访调研，噁唑酮和三硝基苯磺酸在临床上应用广泛，效果明显，具有可行性。