APP_PSN双转基因痴呆症小鼠模型

一、 AD简介

临床症状主要表现为记忆、认知、理解、判断推理能力以及社会适应能力、个人生活能力慢性进行性减退，最终发展为严重痴呆。

病理表现主要为大脑内出现老年斑，神经原纤维缠结，神经元丢失等。

发病机制主要包括tau蛋白过度磷酸化，淀粉样蛋白沉积，载脂蛋白E的多态性，淀粉样前体蛋白变异及其转化过程发生改变，氧化应激和代谢损害等。

二、 APP，PS1与AD

APP基因位于染色体21q21.3，由20个外显子和若干内含子组成，由于基因转录后剪接方式的不同，所得的mRNA可翻译生成数种亚型，其中最主要的为APP695，APP751，APP770。APP作为一种管家基因，在多种组织中均有表达，但不同组织表达的APP亚型有所不同，其中APP695在脑组织中表达量最多，APP基因突变引起的AD病例只占总病例的一小部分，但是具有代表性。PS1基因位于14q24.3，到目前为止发现90多个突变点，与早老性AD的发生发展相关。

APP蛋白是一种I型扩莫蛋白，在哺乳动物中有两个同源蛋白APLP1，APLP2。APP翻译后经过N-和O-糖基化，磷酸化以及络氨酸硫酸化等修饰。经过两种途径进行水解，即不产生Aβ的途径和产生Aβ的途径。正常大脑中，APP主要经过α分泌酶进行水解，其在Aβ区段由α分泌酶水解，从而阻止Aβ的形成。一旦APP水解异常，将会导致大脑内Aβ的聚集，形成老年斑。PSI蛋白是一个内含有467个氨基酸的多次跨膜蛋白，定位于内质网，高尔基体及细胞表面。PSI作为γ分泌酶的催化亚基，其表达异常导致APP水解异常，从而参与了大脑内老年斑的形成。

利用PrP-hAPPK595N/M596L和PrP-hPS1δE9双转基因培育而成。背景品系是C57BL/6J，启动子为Mouse prion protein（PrP）, 靶基因信息：Human presenilin 1 and APP。

1、基因型鉴定

利用PrP-hAPPK595N/M596L转基因小鼠和PrP-hPS1δE9转基因小鼠进行杂交，所得新生小鼠1 周内剪鼠尾进行PCR 鉴定APP/PSN转基因动物的基因表型鉴定, 保留阳性小鼠。转基因小鼠在出生9 ～ 14 d 用剪趾法标记, 收集剪下的组织及鼠尾, 用碱裂解法提取基因组DNA , PCR 分别检测APPK595N/M596L 及hPS1δE9基因的表达。APP基因PCR 产物长344 Kb , PSN基因PCR 产物长608 Kb。

PCR 鉴定APP 转基因动物的凝胶电泳分析

2、APP/PSN双转基因AD小鼠的病理表现

5月龄出现老年斑，12月龄有大量老年斑形成。

3、APP/PSN双转基因AD小鼠的行为表现（水迷宫实验）

经过检验前5 d 学习有效, 所有小鼠都能较快的找到平台。随后第6天撤出平台, 进行空间探索实验。Ethovision XT 监测分析软件记录小鼠在目标区域(即第4 、5 区)的穿梭次数和停留时间。Morris水迷宫试验发现3 、6 、9 月龄APP/PSN双转基因小鼠空间探索实验结果与同月龄野生型小鼠相比有显著差异, 较同月龄野生型C57BL/6J小鼠学习及记忆能力降低。

Morris 水迷宫第六天空间探索实验结果比较

本实验采用健康成年SPF级老鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

给予动物鼠笼倾斜、潮湿垫料、高温、噪音、束缚、电击、游泳、昼夜节律颠倒等不同刺激因子，且刺激因子安排为多变性和不可预测，可诱导性是模型制造成功的关键。该模型被广泛用于抑郁症神经生物学机制及抗抑郁药物的研究，以及伴发的焦虑、学习记忆障碍及防护药物研究。

本研究中，通过水迷宫实验、避暗实验结果可以看CUMS模型组水迷宫寻台潜伏期显著性延长，避暗错误次数显著性增加、避暗潜伏期显著性减少等，这些行为学结果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本实验还对CUMS模型的机制进行了基础研究，认为CUMS模型会导致动物皮层的5-HT、DA、Ach、NE等神经递质水平显著性降低（P<0.05）。因此我们认为采用慢性不可预测应激，35天可以造成大鼠和小鼠学习记忆障碍。

模型技术难点在于对于CUMS刺激因子的选择，刺激因子的选择可能影响实验模型的成功与否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、热水游泳(42 °C，5 min)、动物叫声(0.5 h)、束缚(使用自行研发的小鼠行为限制器，长20 cm，直径7 cm)、昼夜颠倒、配对饲养、湿笼、倾笼等。每日选择2~3 种刺激，并尽量使应激程序符合不可预测的特点，以避免动物产生适应性。相同的刺激因子应该隔3-7日再进行。

本研究通过不同的刺激因子对老鼠造成慢性不可预测应激模型，通过水迷宫、避暗等经典行为学指标，以及5-HT、DA、Ach、NE等神经递质基础机制指标，表明了慢性不可预测应激诱导老鼠学习记忆损伤模型的成功，并且该模型对于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于进一步的改善学习记忆药物的药效学评价。