STAT3基因敲除肺结核小鼠模型

一、疾病概述

肺结核（Pulmonary tuberculosis，PTB）是世界高死亡率的严重传染病之一。PTB是由各种分支杆菌菌株引起的，结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）大多在人类中观察到。根据世界卫生组织（世卫组织）的报告，2017年全世界有1000万新病例PTB疾病和150万例死亡（世卫组织，2018年）。 据估计，世界人口的三分之一是潜伏性感染的Mtb，其中5%至10%会发展为活动性结核病。

主要症状为有较密切的结核病接触史，起病可急可缓，多为低热（午后为著）、盗汗、乏力、纳差、消瘦、女性月经失调等；呼吸道症状有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、不同程度胸闷或呼吸困难。肺部体征依病情轻重、病变范围不同而有差异，早期、小范围的结核不易查到阳性体征，病变范围较广者叩诊呈浊音，语颤增强，肺泡呼吸音低和湿啰音。晚期结核形成纤维化，局部收缩使胸膜塌陷和纵隔移位。在结核性胸膜炎者早期有胸膜摩擦音，形成大量胸腔积液时，胸壁饱满，叩诊浊实，语颤和呼吸音减低或消失。 尽管有微生物治疗，多达一半的结核病幸存者仍具有某种形式的持续性肺功能障碍。肺功能障碍，从轻微异常到严重气喘，可增加呼吸道原因死亡的风险。快速诊断和有效治疗对于控制PTB的传播和降低其死亡率非常重要。尽管对PTB的机理研究开展了了大量工作，但PTB进展中的分子机制仍然不清楚。二、模型背景1、stat3基因信息• 敲除基因名称（NCBI号）：20848• 敲除基因NCBI网址链接：http://ncbi.nlm.nih.gov/gene/20848• 敲除基因名称（MGI号）：Stat3 (MGI:103038)• 敲除基因Ensembl网址链接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?g=ENSMUSG00000004040;r=11:100885098-100939540• 方案针对的转录本（Ensembl号）：ENSMUSG000000040402、实验动物背景信息所采用的小鼠品系为C57BL/6。来源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57号与雄鼠52号交配而得C57BL1937年从C57BL分离出C57BL/6和C57BL/10两个亚系。1985年从Olac引到中国医学科学院实验动物研究所。毛色：黑色。主要特性：①乳腺肿瘤自然发生率低，化学物质难以诱发乳腺和卵巢肿瘤。②12%有眼睛缺损;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%为小眼或无眼。用可的松可诱发腭裂，其发生率达20%。③对放射物质耐受力中等;补体活性高;较易诱发免疫耐受性。④对结核杆菌敏感。对鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干扰素产量较高。⑥嗜酒精性高，肾上腺素类脂质浓度低。对百日咳组织胺易感因子敏感。⑦常被认作"标准"的近交系，为许多突变基因提供遗传背景。主要用途：是肿瘤学、生理学、免疫学、遗传学研究中常用的品系。3、研究背景（1）研究目的及意义： 探究STAT3在结核病病理过程中所发挥的作用及相关机制，从而为结核病的防治提供新见解。（2）国内外进展： 信号转导和转录激活因子3（Signal transduction and activator of transcription 3, STAT3）是STAT蛋白家族的成员，参与细胞生长、凋亡、癌变等多种生命活动1, 2。外源和内源刺激通过影响STAT3的磷酸化、STAT3基因表达、STAT3与靶基因的相互作用来调节STAT3信号通路。STAT3的转录活性主要是由单个酪氨酸残基Tyr705磷酸化激活，又称为STAT3 经典激活途径；STAT3的酪氨酸磷酸化可以直接由受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase, RTK）如EGFR、KDR、MET 催化，也可以由非受体酪氨酸激酶（Janus kinase, JAK）催化3, 4。JAK-STAT 信号通路由三个成分组成：酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK 和转录因子STAT。细胞因子及其他刺激因素与酪氨酸激酶相关受体结合后引起受体分子的二聚化，使得与受体偶联的JAK相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK催化STAT发生磷酸化修饰，形成同源或异源二聚体进入细胞核内与靶基因结合，调控基因的转录5, 6。 STAT3在结核分支杆菌感染期间被激活。髓系细胞是结核分支杆菌的主要靶点。STAT3激活根据细胞类型触发促炎或抗炎反应。STAT3转录因子具有矛盾的作用：主要激活髓系细胞的抗炎程序，同时促进炎性T细胞的分化和激活。STAT3是T细胞反应的所有阶段的主要参与者，包括T细胞亚群分化、T细胞活化和记忆生成。STAT3信号被一系列细胞因子激活，包括IL-6、IL-10、IL-21、IL-23、IL-27和G-CSF，这些细胞因子在结核分支杆菌感染过程中对巨噬细胞和DC反应有不同的调节作用7。 据报道，STAT3可直接激活IL-10和TGF-β基因的转录8。IL-6还通过STAT3介导的机制降低MHC-II表达抗原的能力9。此外，STAT3已经被证明可以竞争NF-κB Rel与IL-12p35启动子的结合来抑制其转录10。此外，NF-κB和STAT3的一些靶基因重叠，这两个转录因子同时参与正和负串扰5。来自人类和小鼠系统的遗传和生化证据表明，STAT3需要产生IL-10诱导的抗炎反应11。骨髓中性粒细胞的产生和动员受G-CSF的控制，STAT3是G-CSF R激活的主要STAT蛋白12。G-CSF诱导的STAT3激活也通过调节CXCL2 R和lipocalin 2分泌的表达来控制中性粒细胞的迁移和趋化性13。造血祖细胞中有条件缺乏STAT3的小鼠会发展成中性粒细胞，而这些动物的骨髓细胞对G-CSF刺激反应过度14。分支杆菌驱动IL-6、IL-10和G-CSF的产生，随后通过STAT3信号通路诱导未感染巨噬细胞中Arg1的表达15。 STAT3在控制结核分支杆菌感染中具有重要作用7。关于STAT3激活或STAT3依赖性细胞因子在感染结果中的作用的研究支持了该途径的重要性。STAT3可阻断吞噬小体的成熟、NO和活性氧的最佳释放、巨噬细胞自噬和凋亡的诱导、IL-12的释放、抗原呈递和共刺激分子在树突状细胞上的表达。所有这些功能可能对结核分支杆菌的控制有重要作用。STAT3可诱导SOCS3表达，后者通过负反馈回路中的特定细胞因子受体调节STAT3的激活。STAT3还通过G-CSF和IL-17参与粒细胞募集，并参与抗菌肽和蛋白水解酶的分泌。STAT3和SOCS3也在调节T细胞功能中发挥作用，从而控制结核分支杆菌。STAT3和SOCS3控制Th1、Th17和Tfh分化，以响应IL-6、IL-10、IL-12、IL-21和IL-27，而STAT3可抑制Tregs的生成。SOCS3和STAT3在控制分泌IL-17的γδ+T细胞的扩张中也有重要作用，而γδ+T细胞在结核分支杆菌感染的结果中起着尚未确定的有害作用16。与SOCS3的保护作用相反，STAT3的作用有些自相矛盾。它降低髓系细胞保护功能的效率，但调节与保护或损伤相关的炎性T细胞的分化，并参与记忆细胞的分化。STAT3和SOCS3也可以调节非造血细胞的活性，从而间接影响结核分支杆菌感染的预后7。 此外，STAT3不仅在结核病的病理过程中发挥重要作用，还被证明在多种疾病的发病过程中扮演重要角色，包括其他感染性疾病、肿瘤、心血管疾病和神经退行性疾病等17。参考文献：1. Yu H, Pardoll D and Jove R. STATs in cancer inflammation and immunity: a leading role for STAT3. Nat Rev Cancer. 2009;9:798-809.2. Fan Y, Mao R and Yang J. NF-kappaB and STAT3 signaling pathways collaboratively link inflammation to cancer. Protein Cell. 2013;4:176-85.3. Yu H, Lee H, Herrmann A, Buettner R and Jove R. Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions. Nat Rev Cancer. 2014;14:736-46.4. Johnson DE, O'Keefe RA and Grandis JR. Targeting the IL-6/JAK/STAT3 signalling axis in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2018;15:234-248.5. He G and Karin M. NF-kappaB and STAT3 - key players in liver inflammation and cancer. Cell Res. 2011;21:159-68.6. You L, Wang Z, Li H, Shou J, Jing Z, Xie J, Sui X, Pan H and Han W. The role of STAT3 in autophagy. Autophagy. 2015;11:729-39.7. Rottenberg ME and Carow B. SOCS3 and STAT3, major controllers of the outcome of infection with Mycobacterium tuberculosis. Semin Immunol. 2014;26:518-32.8. Benkhart EM, Siedlar M, Wedel A, Werner T and Ziegler-Heitbrock HW. Role of Stat3 in lipopolysaccharide-induced IL-10 gene expression. J Immunol. 2000;165:1612-7.9. Kitamura H, Kamon H, Sawa S, Park SJ, Katunuma N, Ishihara K, Murakami M and Hirano T. IL-6-STAT3 controls intracellular MHC class II alphabeta dimer level through cathepsin S activity in dendritic cells. Immunity. 2005;23:491-502.10. Hoentjen F, Sartor RB, Ozaki M and Jobin C. STAT3 regulates NF-kappaB recruitment to the IL-12p40 promoter in dendritic cells. Blood. 2005;105:689-96.11. Williams L, Bradley L, Smith A and Foxwell B. Signal transducer and activator of transcription 3 is the dominant mediator of the anti-inflammatory effects of IL-10 in human macrophages. J Immunol. 2004;172:567-76.12. McLemore ML, Grewal S, Liu F, Archambault A, Poursine-Laurent J, Haug J and Link DC. STAT-3 activation is required for normal G-CSF-dependent proliferation and granulocytic differentiation. Immunity. 2001;14:193-204.13. Panopoulos AD, Zhang L, Snow JW, Jones DM, Smith AM, El Kasmi KC, Liu F, Goldsmith MA, Link DC, Murray PJ and Watowich SS. STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils. Blood. 2006;108:3682-90.14. Kamezaki K, Shimoda K, Numata A, Haro T, Kakumitsu H, Yoshie M, Yamamoto M, Takeda K, Matsuda T, Akira S, Ogawa K and Harada M. Roles of Stat3 and ERK in G-CSF signaling. Stem Cells. 2005;23:252-63.15. Qualls JE, Neale G, Smith AM, Koo MS, DeFreitas AA, Zhang H, Kaplan G, Watowich SS and Murray PJ. Arginine usage in mycobacteria-infected macrophages depends on autocrine-paracrine cytokine signaling. Sci Signal. 2010;3:ra62.16. Michel ML, Pang DJ, Haque SF, Potocnik AJ, Pennington DJ and Hayday AC. Interleukin 7 (IL-7) selectively promotes mouse and human IL-17-producing gammadelta cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109:17549-54.17. Ye S, Luo W, Khan ZA, Wu G, Xuan L, Shan P, Lin K, Chen T, Wang J, Hu X, Wang S, Huang W and Liang G. Celastrol Attenuates Angiotensin II-Induced Cardiac Remodeling by Targeting STAT3. Circ Res. 2020;126:1007-1023.

（1）鉴定引物信息：

（2）鉴定PCR结果图解

1恒河猴感染结核菌后OT实验

3只恒河猴感染结核分支杆菌后的第4周进行OT试验，右侧眼睑明显出现红肿，存在一定程度的闭合，个体间有一定差异。旧结核菌素反应均可判断为阳性。 图1

图1 猴眼睑OT实验

2恒河猴感染结核菌前后体重的变化

3只恒河猴感染结核分支杆菌前动物的体重都呈上升趋势。在感染结核菌之后的前两周相比感染前体重也有上升。但是在感染结核菌后的4周和6周动物的体重均出现下降。在感染后的第9周B1和C6的体重基本稳定，C8的体重表现为上升。结果如图2。

图2 实验猴的体重变化曲线

3恒河猴感染结核菌前后体温的变化

3只恒河猴感染结核分支杆菌之后的前两周相比感染前体温相对稳定。但是在感染结核菌后的4周体温升高，感染后第6周动物的体温出现一定程度的下降，但仍高于正常体温。在感染后的第9周C6的体温仍较高。B1和C8的体温降至39度以下。B1和C8目前表现为一过性的低热，C6的体温变化仍需继续观测。结果如图3。

图3 实验猴的体温变化曲线

4恒河猴感染结核菌前后血沉变化

3只恒河猴感染结核分支杆菌之后的前两周相比感染前血沉相对稳定。但是在感染结核菌后的4周C6的提高，感染后第6周3只猴的血沉都有一定程度的提高。在感染后的第9周B1、C6的血沉仍较高。C8的血沉降至较低水平。结果如图4。

图4 实验猴感染后血沉变化曲线

5恒河猴感染结核菌前后CRP变化

3只恒河猴感染结核分支杆菌之后的前两周相比感染前CRP相对稳定。但是在感染结核菌后的4周、6周、9周B1、C6的CRP升高。C8的CRP在感染结核后一直维持在较低水平。结果如图5。

图5 实验猴感染后C反应蛋白变化曲线

6影像学检测结果

恒河猴C6 CT胸部影像和胸部X光检查结果显示其右肺中下叶存在实变影，纵隔发生右向移位，心脏偏于右侧，这可能是右侧肺中下叶不张引起。右肺上叶和左肺多处存在片状实变影，散点状结节影多见。根据CT和X光检测的结果判断有支气管结核和肺结核的可能。如图6

恒河猴B1 CT胸部影像和胸部X光检查结果显示其右肺下叶存在片状影，纵隔发生右向移位，心脏偏于右侧，这可能是右侧肺下叶不张引起。肺组织偶见散点状结节影。如图7

恒河猴C8 CT胸部影像和胸部X光检查结果显示其右肺中下叶后段存在渗出影，CT能动态监测右肺叶的病变, 如图8。由于C8猴的病变较轻，因此在CT引导下进行组织病理活检，确证结核感染。如图9

图6 C6猴的动态影像学变化

a-c: 胸部X光；d-f:胸部CT，其中d、e为横断面图，f为纵切面图，箭头所指为结核病变区

图7 B1猴的动态影像学变化

a-b: 胸部X光；c-f:胸部CT，其中c、d、e为横断面图，f为纵切面图，箭头所指为结核病变区

图8 C8猴的动态影像学变化

a-c: 胸部X光；d-h:胸部CT，均为横断面图，箭头所指为结核病变区

图9 C8猴的肺组织在CT引导下活检结果

左上图a为胸部CT横断面图；右上图b为组织病理图，箭头所指为肉芽肿区；

左下图a为另一时间点胸部CT横断面图；右下图b为组织病理图，c、d是b图中朗格罕氏细胞的放大图。

7结核抗体检测

采用临床人类使用的结核抗体检测的胶体金法对感染动物的血清进行了分析。在动物感染结核菌6周和9周时结核抗体阳性。下图显示6周时血清抗体检测结果。而在感染结核菌2周和4周时结核抗体表现为弱阳性。值得注意的是恒河猴感染前血清检测时也可以看到结核抗体的弱阳性。图10

图10 猴血清的结核抗体检测

胶体金法检测，A:阴性对照，B：阳性对照，C:C6猴血清抗体阳性

D:B1猴血清抗体阳性，E: C8猴血清抗体阳性

8病理病变

大体病理：

肺组织各叶可见结核结节及渗出性病变，以右肺中下叶病变最重；肝细胞脂肪变性，肝脏内内可见多个结核结节；脾脏内可见多个结核结节；肾被膜下多灶性炎细胞浸润，可见少数结核结节；心房多灶性炎细胞浸润（以巨噬细胞为主）；附睾内可见结核结节；睾丸灶性坏死及炎细胞浸润；胃粘膜炎细胞浸润；支气管旁淋巴结、肺门淋巴结可见巨大结核结节；大肠、小肠、脑组织、胆囊、胰腺、腹股沟淋巴结未见明显异常；

组织病理：

肺脏各叶可见多个结核结节，大部分结核结节中央可见干酪样坏死，周围类上皮细胞及中性粒细胞、淋巴细胞围绕，可见郎罕氏巨细胞。结核结节可融合，形成较大病灶。结核结节周围肺泡腔内充满浆液性渗出物。支气管腔内可见粘液脓性物质。以右肺中下叶病变最重。脾脏可见多个结核结节。部分结核结节中央可见干酪样坏死，周围类上皮细胞及中性粒细胞、淋巴细胞围绕，可见郎罕氏巨细胞。肝脏可见多个结核结节。部分结核结节中央可见干酪样坏死，周围类上皮细胞及中性粒细胞、淋巴细胞围绕，可见郎罕氏巨细胞。轻度肝细胞脂肪变性。

肾脏被膜下多灶性炎细胞浸润，肾小球及肾小管结构破坏。肾组织内可见少数结核结节。附睾可见结核结节，由类上皮细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎细胞构成。支气管旁淋巴结可见巨大结核结节，中央为大片干酪样坏死区，周围类上皮细胞及中性粒细胞、淋巴细胞围绕，可见郎罕氏巨细胞。肺门淋巴结可见巨大结核结节，中央为大片干酪样坏死区，周围类上皮细胞及中性粒细胞、淋巴细胞围绕，可见郎罕氏巨细胞。幽门淋巴结可见结核结节，中央为干酪样坏死，周围类上皮细胞及中性粒细胞、淋巴细胞围绕，可见郎罕氏巨细胞。图11

图11猴结核的大体和组织病理图

a-d：分别为肺、脾、肾、肝的大体病理，箭头所指为肉眼可见的结核结节；

e:肺组织病理中可见的结核肉芽肿；f:肺组织病理中可见肉芽肿，并有坏死空洞；

9 组织菌培养

猴的所有肺叶、肺门淋巴结、支气管淋巴结的结核菌的荷菌量很高，脾、肾组织中中等水平荷菌量，肝、附睾、腹股沟淋巴结的荷菌量很低。其它组织的菌培养为阴性。在观察期间肺组织的活检培养为阳性。

模型动物饲养在武汉大学人民医院动物房SPF级动物实验室，实验动物使用许可证SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特点

门采用专用净化密闭门并配备观察窗。单向走道呈顺时针走向设计。屏障系统内共有大鼠饲养室1间，小鼠饲养室3间，隔离观察室1间，实验准备室1间，洁物存放室1间，清洗消毒室1间。此外，屏障系统外配有监控室、机房和配电室等。

（2）设计参数

室内温度：20～26°C；日温差：≤4°C；相对湿度：40%～70%；换气次数：15～20次/h；气流速度：≤0．2m/s；压强梯度：20～50Pa；空气洁净度：7级；菌落数：≤3个/皿；氨浓度：≤14mg/m3；噪声：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；动物照度：15～20lx；昼夜明暗交替时间：12/12h。

（3）通风和空调系统

动物实验室采用全新风中央空调通风系统。空气经过初、中、三级过滤器后进入实验室内环境。

（4）照明系统

一更、淋浴、二更、气闸、清洁走道、洁物存放处、污物走道、缓冲间和清洗消毒间、动物饲养室、实验准备间、隔离观察室和功能实验室等安装有手动和自动开关，根据实际需要，调节控制室内照明灯。未启用房间、清洁走道、洁物存放处、污物走道等在每日中午12点和晚上8点开启紫外线灯照射1h。

（5）通讯系统

因为SPF级动物实验室的环境和设施具有特殊要求，人员进入后不能随意出入，而室内外的联系又十分重要，故室内各房间均安装内部电话机，按照房间顺序编排电话号码，各室内电话可相互连通，并均与监控室总机保持联系，保证实验室内外信息的及时沟通。

（6）监控系统

对SPF级动物实验室的出入口、走道、实验动物饲养室、功能操作室等重要位置均安装了可作270°旋转的摄像机，能够及时了解设施的运行状态；也能有效督促实验人员执行科学的操作规程，避免人为因素造成室内环境和设施的污染；并对整个实验期间的动物状态和反应进行观察，减少对动物的滋扰。

（7）供水系统

SPF级实验动物饮用水以纯净水为宜。本实验室采用管道供水，将处理后的纯净水用塑胶管道输送到屏障系统内实验准备室，设置接水槽，为实验动物供应灭菌的饮用水和屏障系统内用水。要经常更换和清洗输水管道，清洗笼具的用水添加适当比例的84消毒液。

（8）供电系统、警报系统和消防设施

SPF级动物实验室要求全天候不间断供风和供电，如果出现故障，不能及时发现和处理，就可能导致环境设施的污染、动物感染或死亡，造成严重后果。因此应对SPF级动物实验室使用独立稳定的供电系统，并配备有应急电源。在中央空调机房控制室安装风机故障警报系统，以便及时检修和维护，保证设施的安全运行。

（9）消毒灭菌设备

为防止外界物品进入SPF级动物实验室时所携带的细菌污染室内环境和造成动物交叉感染，按照不同物品的特性，进行紫外线照射消毒、渡槽消毒液消毒或专用的机动门真空灭菌器消毒。

（10）动物饲养笼具

饲养大、小鼠的笼具聚碳酸脂材料的塑胶笼具，具有高透明、耐高压、耐高温、耐酸碱等特点。通用的不锈钢笼具长、宽、高分别为40、30、20cm，适用于单笼饲养有特殊要求的实验动物，配有底盘和食槽，确保实验动物有充足的采食和活动空间，同时也保证室内环境的清洁。

（11）垫料的选择和使用

在使用塑胶垫料时，垫料是大小鼠直接接触的铺垫物，起到吸湿、保暖和造窝的作用。垫料的好坏直接影响到大小鼠术后的恢复、生长发育和繁殖性能。目前，所使用的垫料主要有玉米秸垫料、刨花垫料。

（12）饲料配制

大小鼠的生产型饲料和维持型饲料必须严格按照国家标准，进行科学配制生产。每半年检测一次饲料的微生物指标和有效营养成分指标，保证饲料的质量。

STAT3基因敲除小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技术的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外显子或几个总要的外显子功能区敲除掉，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。

CRISPR/Cas9技术的优点在于其对基因进行定位的精准编辑，在向导RNA（guide RNA）和Cas9蛋白的共同作用下，细胞基因组DNA（被看成外源DNA）将被准确剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要满足几个条件。第一，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（NGG）。第二，向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。

STAT3基因敲除小鼠模型为完全性基因敲除模型（KO），STAT3基因在小鼠的任意组织器官均被敲除。该模型应用范围广，可以制造针对各类疾病不同组织器官细胞的疾病模型。