伯式疟原虫ANKA感染C57BL/6J小鼠脑型疟模型

1.目的

脑型疟（cerebralmalaria，CM）是恶性疟原虫感染引起的高死亡率、高致残率的神经系统并发症。截止目前，脑型疟发病机制尚不明确，由于伦理等原因，科学家难以用实验技术和手段研究人脑，严重阻碍了脑型疟的基础和应用研究。C57BL/6J小鼠属于病原微生物易感品系，可发展至致死性脑病理特征。伯氏疟原虫ANKA（Plasmodium BergheiANKA, PbA）感染C57BL/6J小鼠引起的病理学和免疫应答，可复制并模拟人类CM认知功能障碍、血脑屏障破坏及神经组织损伤等不同临床表现。构建PbA感染导致的实验型脑型疟模型（ECM），结合临床研究，可用于充分阐明脑型疟病理机制，并通过建立ECM药效评价体系，用于新型抗脑型疟药物的功效评价。

2.意义

脑型疟发病凶险，死亡率极高，据2021年世界疟疾报告显示，2020年约有2.41亿疟疾病例，疟疾死亡总数达62.7万，其中5岁以下儿童约占80 %，而74 %的脑型疟病例发生在5岁以下儿童，死亡率为 15-20 %。现有的干预措施仍无法完全解决脑型疟的临床问题，脑型疟迄今仍是非洲（疟疾的“主战场”）儿童死亡的主因之一。在过去几十年中，以提高生存率、减少幸存者的神经损伤为目标的新型抗疟药与辅助治疗研究始终备受关注，但研究结果却普遍令人失望。同时，青蒿素联合疗法（ACTs）是WHO推荐的治疗疟疾的一线药物并挽救了数以百万计人的生命。但在过去几年中，临床上，ACTs治疗效果已在柬埔寨西部地区欠佳，已有报道称非洲地区也出现了青蒿素类药物抗药性问题。如果ACTs疗法失效在非洲开始蔓延，这将是抗击疟疾的重大灾难。继续探索新型治疗药物或优化的青蒿素类抗疟复方组合，降低脑型疟死亡率及远期损伤仍任重而道远。既往Pb ANKA感染C57BL/6J小鼠模型更多地关注动物免疫及炎症病理，本研究通过优化PbA感染剂量、C57BL/6J小鼠体重和感染寄生虫的特定生活周期，能很好地复现并模拟人类CM神经功能障碍等一系列神经体征，如偏瘫、昏迷及抽搐，并且在组织病理学上能复现脑微血管阻塞、脑出血、血管内皮功能障碍等，这为发现脑型疟新型辅助疗法，特别是对神经功能有改善作用的药物药效评价，提供了可靠的评价模型。

3.国内外研究进展

国内外文献中已报道的疟疾模型类型多样，许多小鼠模型被用来模拟致命性和非致命性疟疾，通常涉及啮齿动物近交系小鼠感染疟原虫株，如Plasmodium Chabaudi、Plasmodium Yoelii、Plasmodium Vinceki和Plasmodium Berghei等，但用来研究CM的仅有Plasmodium Yoelii和 Plasmodium Berghei两种疟原虫株。其中Plasmodium Berghei是所有疟原虫株中能引起小鼠、仓鼠和大鼠CM的虫株，Plasmodium BergheiSP11，ANKA，NK65，K173都曾被用来研究CM。Grau等人利用PbA在CBA/Ca小鼠中的多克隆系和细胞因子单克隆或多克隆抗体证明了γ干扰素（IFN-g）、TNF-a、IL-3和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的参与[1]，Hermsen等人报道循环TNF-a不参与感染Plasmodium BergheiK173的C57BL/6小鼠ECM的发展[2]。由PbA多克隆系衍生的多个克隆系均可引起ECM，但ECM诱导程度与接种量有关。研究人员还观察到ECM特征（生存时间和低温）存在细微的差异[3]。由于PbA株能引起CM小鼠神经症状，因此它是脑型疟疾研究中最常见的毒株，即从2000年到2008年，只有5项CM研究使用了Pb K173，相比之下，PbA有97项。CM易感小鼠系包括CBA/J、CBA/HN、C57BL/6J，C57BL/6N、SLJ/J、Swiss等， CM中129研究在C57BL/6J或C57BL/6N小鼠完成，其他敏感小鼠 （CBA/ca、CBA/ J、CBA/HN、SLJ/J、129/Ola、Swiss和NMRI）的使用频率较低[4-7]，但Pb ANKA感染C57BL/6J小鼠能复制人类CM病理特征，成为疟疾生物学家最有吸引力的选择[8-12]。

但是上述PbA感染小鼠模型更多地关注动物免疫及炎症病理，本研究通过优化PbA感染剂量、C57BL/6J小鼠性别及体重和感染寄生虫接种量及其特定生活周期，能很好地复现并模拟人类CM神经功能障碍等一系列神经体征，如偏瘫、昏迷及抽搐，并且在组织病理学上能复现脑微血管阻塞、脑出血、血管内皮功能障碍等。同时，我们探究了脑型疟神经损伤的病理机制及药物改善神经功能的药理机制，验证了pfEMP1在脑型疟致病过程中的病理作用，并揭示了药物通过NO介导的蛋白亚硝基化修饰途径发挥保护ECM小鼠神经及血管功能的药理作用。

参考文献

[1]Grau, G. E., L. F. Fajardo, P. F. Piguet, B. Allet, P.-H. Lambert, andP. Vassalli. Tumor necrosis factor (cachectin) as an essential mediatorin murine cerebral malaria. Science, 1987. 237:1210–1212.

[2] Hermsen, C. C., J. V. D. Crommert, R. W. Sauerwein, and W. C. M. Eling.Circulating tumor necrosis factor a is not involved in the developmentof cerebral malaria in Plasmodium berghei-infected C57BL mice. ParasiteImmunology, 1997. 19:571–577.

[3] Amani V, Boubou M I, Pied S, et al. Cloned lines of Plasmodium berghei ANKA differ in their abilities to induce experimental cerebral malaria[J]. Infection and immunity, 1998, 66(9): 4093-4099.

[4]Rénia L, Potter S M, Mauduit M, et al. Pathogenic T cells in cerebral malaria[J]. International journal for parasitology, 2006, 36(5): 547-554.

[5] Bagot, S., et al. "Susceptibility to experimental cerebral malaria induced by Plasmodium berghei ANKA in inbred mouse strains recently derived from wild stock." Infection and Immunity, 2002, 70.4: 2049-2056.

[6]Delahaye N F, Coltel N, Puthier D, et al. Gene expression analysis reveals early changes in several molecular pathways in cerebral malaria-susceptible mice versus cerebral malaria-resistant mice[J]. BMC genomics, 2007, 8(1): 1-16.

[7]Martins Y C, Smith M J, Pelajo-Machado M, et al. Characterization of cerebral malaria in the outbred Swiss Webster mouse infected by Plasmodium berghei ANKA[J]. International journal of experimental pathology, 2009, 90(2): 119-130.

[8]de Kossodo S, Grau G E. Profiles of cytokine production in relation with susceptibility to cerebral malaria[J]. The Journal of Immunology, 1993, 151(9): 4811-4820.

[9]Delahaye N F, Coltel N, Puthier D, et al. Gene-expression profiling discriminates between cerebral malaria (CM)–susceptible mice and CM-resistant mice[J]. Journal of Infectious Diseases, 2006, 193(2): 312-321.

[10] Lackner P, Beer R, Heussler V, et al. Behavioural and histopathological alterations in mice with cerebral malaria[J]. Neuropathology and applied neurobiology, 2006, 32(2): 177-188.

[11] Howland S W, Claser C, Poh C M, et al. Pathogenic CD8+ T cells in experimental cerebral malaria[C]//Seminars in immunopathology. Springer Berlin Heidelberg, 2015, 37(3): 221-231.

[12] Waknine-Grinberg J H, Even-Chen S, Avichzer J, et al. Glucocorticosteroids in nano-sterically stabilized liposomes are efficacious for elimination of the acute symptoms of experimental cerebral malaria[J]. PLoS One, 2013, 8(8): e72722.

1实验材料 1.1实验动物和疟原虫株

实验动物选用SPF级C57BL/6J小鼠，雄性16-18g，由中国食品药品检定研究院，许可证号SCXK(京)2014-0013。伯氏鼠疟恶性疟原虫株Plasmodium berghei ANKA（Pb ANKA），第四军医大学赵亚教授实验室惠赠，本实验室进行传代，液氮中冻存并长期保存。

1.2实验材料

Giemsa染液，批号SLBT6353，Sigma 公司；

HE染液，批号G1005，武汉赛维尔生物科技有限公司；

冻存液：28%甘油， 3%D-山梨醇和0.65% NaCl

2实验方法

2.1建立小鼠实验脑型疟模型

2.1.1复苏与传代

将液氮冻存的 PbA疟原虫株取出置于37℃水浴锅中，待溶化后用1mL注射器吸取血液，按照0.2mL/只的剂量立即腹腔接种于C57BL/6J小鼠中，此为血种复苏。待血种鼠原虫血症水平达 15%-30%时，摘眼球取血于肝素抗凝管中，摇匀后用 1 mL 注射器吸取血液，按照 0.2 mL/只的剂量血传于子代C57BL/6J小鼠。

2.1.2动物分组与疟原虫接种

将C57BL/6J小鼠进行称重，分为空白组(control)和模型组(ANKA)两组。实验小鼠适应性喂养后，待子代C57BL/6J小鼠原虫血症水平达15%-30%时，腹腔注射0.2mL(含1× 106个染虫红细胞)接种于模型组C57BL/6J小鼠，记为接种第0天。空白组小鼠腹腔注射0.2mL生理盐水。

2.2观察指标及测定方法

2.2.1原虫血症水平

模型组小鼠尾尖取一小滴血，滴于载玻片上，用另一载玻片的边缘成一定角度将血滴向一端推开，制成厚薄适宜的薄血膜，薄血膜风干后用甲醇将薄血膜固定，放置至完全风干。将吉姆萨染液1:9稀释染色( 完全覆盖已固定的薄血膜)20min后，置于水龙头下冲洗并用滤纸快速吸干表面水份。滴一滴香柏油于载玻片上，100 倍油镜下镜检，计数1000个红细胞中包含的染虫红细胞数，原虫血症水平=染虫红细胞数/总红细胞数。

2.2.2生存率

每日观察小鼠存活情况，存活率=存活小鼠/实验总小鼠×100%

2.2.3体重

接种第2天开始对实验小鼠每天测量体重。

2.2.4苏木精-伊红(HE)染色观察实验小鼠微血管阻塞情况

接种第8天小鼠实行安乐死，开胸心内灌注20mLPBS溶液后取海马和小脑，将组织浸入多聚甲醛溶液浸泡24h，将组织切成4-5μm切片并进行脱蜡，酒精梯度水化后用自来水冲洗3次，5min/次；浸入苏木素染液染色10min后自来水浸洗5min，重复3次；浸入盐酸酒精溶液进行分化，自来水浸洗3次，5min/次，浸入伊红染液染色2min后重复用自来水浸洗；再经常规脱水后，用二甲苯透明，中性树脂固封后光学显微镜下进行观察并拍照。显微镜下观察附着于内皮的白细胞、红细胞和白细胞阻塞、出血情况。

2.2.5小鼠昏迷及行为量表评分 根据快速评估小鼠昏迷及行为量表(RMCBS)，结合本实验室条件进行筛选优化在 180s内从协调能力、探索行为、力量和骨骼、反射和自我保护和卫生行为5个方面对ECM小鼠中枢神经系统功能进行客观评价。具体从7个表现最明显的方面，包括步态和运动相关行为、身体所在位置、触摸反应、耳廓反射、脚趾触碰反应以及卫生行为进行评分。从接种第1天开始，将小鼠从左上角放入放入底面铺格子纸的长×宽×高分别为31.8cm×19.8cm×10.5cm的盒子中，触击物为3mm直径的杆，检测时间为3min。 进行RMCBS得分评估时，在观察的前90s内，对小鼠进行卫生行为、步态、身体姿势、探索性行为进行相关评估，正常小鼠具有光滑、梳理过的光泽皮毛、步态稳定、走路时身体呈伸展姿态、15s内即可探索网格框的四个边角；而病态小鼠皮毛杂乱、走路时共济失调、后背拱起、15s内只能探索三个或者更少的边角。在后90s内，观测小鼠的触摸反应、耳廓反射和脚趾反应，正常小鼠遇到触击时将会跳起，触击杆触碰到耳廓时耳朵出现弹动并能反射性地将后腿从触击脚趾处拉开；而刺激病态小鼠时反射减少或无反射运动。根据小鼠表现进行打分，每项分数为0-2分，总分为14分，根据得分追踪ECM疾病进展。

（一）青蒿琥酯川芎嗪组合对ECM药效作用探索

1.材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物和疟原虫株

实验动物选用SPF级C57BL/6J小鼠，雄性 16-18g，由中国食品药品检定研究院，许可证号SCXK(京)2014-0013。伯氏鼠疟恶性疟原虫株Plasmodium berghei ANKA（Pb ANKA），第四军医大学赵亚教授实验室惠赠，本实验室进行传代，液氮中冻存并长期保存。

1.1.2实验试剂

Giemsa染液，批号SLBT6353，Sigma 公司；

青蒿琥酯，批号C00220171106，重庆华方武陵山制药有限公司；

盐酸川芎嗪注射液，批号P18050701，北京永康药业有限公司；

HE染液，批号G1005，武汉赛维尔生物科技有限公司；

凝血酶原时间测定试剂盒 R01001 20190715M 雷杜生命科技

活化部分凝血活酶时间测定试剂盒 R01101 20190814M 雷杜生命科技

纤维蛋白含量测定试剂盒 R01301 20190730M 雷杜生命科技

VCAM-1 兔多克隆抗体，11444-1-AP，Proteintech；

ICAM-1 抗体，60299-1-Ig，Abcam；

1.1.3实验仪器 Olympus 显微镜 型号CX31 日本 SH便携式数字测温仪，天津市津安瑞仪器仪表有限公司 全自动凝血分析仪 RAC-030 深圳雷杜生命科技 1.1.4药物配制 盐酸川芎嗪注射液，4℃保存，即开即用，其他给药按照比例计算。AS称取45mg先溶于0.6mL的5%碳酸氢钠溶液中至澄清，再加入5.4mL的生理盐水，现用现配。按上述配好两药后，按比例混匀。 2实验方法

2.1ECM模型建立与测定方法

2.1.1建立小鼠实验脑型疟模型

2.1.1.1复苏与传代

将液氮中保存的Plasmodium berghei ANKA（Pb ANKA）疟原虫株取出，37℃水浴锅中解冻，待融化，用注射器吸取血液，按照0.2mL/只腹腔注射接种C57BL/6J小鼠。待接种小鼠感染率达15-30%，尾尖取血于抗凝血管中，摇匀后按照0.2mL/只血传于下一代小鼠，待小鼠感染率达15%-30%时，即可作种鼠进行接种实验。

2.1.1.2动物分组与疟原虫接种

将C57BL/6J小鼠称重，随机分为5组包括空白对照组（control组）、模型组（Model，M组）、青蒿琥酯组（AS组）、川芎嗪组（TMP组）、联合给药组（AS+TMP组）。实验小鼠适应喂养后，待种鼠感染率达15%-30%，摘眼球取血后计数红细胞总数和染疟红细胞（pRBC）数，按照1×106pRBC腹腔注射0.2mL，接种除control组外其他组小鼠，即为接种第0天（D0），Control组小鼠腹腔注射0.2mL生理盐水。

2.1.1.3给药方式及剂量

从接种后第2天（D2）开始，AS按照7.80mg/kg AS进行滴鼻给药，TMP组按照10.40mg/kg盐酸TMP注射液滴鼻给药，AS+TMP组按照18.20mg/kg青蒿琥酯川芎嗪混合溶液滴鼻给药。滴鼻方法如下：抓取小鼠后使其头部平躺，使用10μL移液枪吸取所需药物与小鼠鼻孔成45°倾斜角度滴入，待其吸入后继续滴入下一滴，左右鼻孔交替给药，直至给药结束，保持此位置15秒以便小鼠将药物完全吸入，D2至D5连续给药四天。

2.1.2观察指标及测定方法

2.1.2.1生存率

接种第0天开始每天观察小鼠的死亡情况，连续统计11天，生存率=生存小鼠只数/实验小鼠只数×100%

2.1.2.2感染率

从D3起每日测定各组小鼠感染率。于小鼠尾尖取血一小滴，滴于病理载玻片上，用另一玻片边缘轻轻推开制成厚度适宜的薄血膜，待风干后使用甲醇固定至干，使用Giemsa染液按照染液与水1:9的比例染色（无气泡，全覆盖血膜）20min，用水冲洗染液并用滤纸吸净水分，晾干。滴香柏油于薄血膜，100倍油镜进行观察计数，计数1000个以上红细胞中pRBC数目，感染率（%）=pRBC数目/总红细胞数×100%。

2.1.2.3体重D2开始，每天固定时间测定小鼠体重水平。

2.1.2.4 ECM小鼠快速昏迷行为量表评分

根据文献和前期实验结果[12]，采用小鼠快速昏迷及行为量表（RMCBS）对其脑部神经功能进行评估。从D0开始，对小鼠进行评分，从步态、平衡性、运动相关行为、身体所处位置、四肢力量、触摸反应、耳廓反射、脚趾触碰反应、进攻反应、进攻行为、卫生行为这10个方面评分。

正常小鼠具有光滑的皮毛、稳定的步态，走路身体舒展，能在15s内探索网格的四个角落，并具有明显的探索行为、触摸行为、耳廓反应、脚趾反应、触及反射等，而病鼠在120 s内探索少，且皮毛杂乱、共济失调、后背拱起，在刺激病鼠时反射减少或消失。根据小鼠表现进行打分，每项分数为0-2分，总共为20分。每日固定时间，固定顺序进行检测，检测时将小鼠从左上角放入底面铺格子纸的长宽高分别为31.8 cm×19.8cm×10.5cm盒子中，使用3mm直径的长杆进行触及，一只小鼠检测时间在3min左右，每只检测后需要擦去上一只留下的印迹。

2.2苏木精-伊红（HE）染色观察小鼠脑组织病理改变

在D7对各组小鼠实行安乐死，开胸于心尖处灌注心脏20mLPBS溶液，至右心耳流出澄清的液体，用弯镊取脑部，浸入4%多聚甲醛溶液，固定24 h后制成蜡块。将组织切成4-5μm切片进行脱蜡，依次将切片放入二甲苯梯度水化20 min，继续用乙醇溶液梯度水化5min/次，自来水洗，重复3次；苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5 min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗；伊红染色：切片依次入85 %、95 %的梯度酒精脱水各5 min，入伊红染液中染色5 min/次，重复3次；继续经过脱水后，使用二甲苯透明，中性树脂封片；显微镜镜检，图像采集分析。

2.3尼氏染色观察尼氏小体变化水平

尼氏染色：将石蜡切片脱蜡、水化后，在56℃恒温孵育尼氏染液浸染1.5h，经水冲洗，尼氏分化液分化2min，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂固定封片。显微镜下观察尼氏小体，并计数。

2.4 FJB染色观察小鼠神经细胞凋亡情况

FJB染色：石蜡切片进行脱蜡及脱水、水洗三次，使用0.06%高锰酸钾溶液室温孵育20 min，水洗5 min/次，重复3次；使用0.0004 % FJB溶液室温孵育20 min，水洗同上；用DAPI复染，室温20 min；中性树脂封片，固定，使用荧光显微镜进行拍照。

2.5凝血指标检测

小鼠眼球取血于3.2 %的枸橼酸钠抗凝管中，轻轻颠倒混匀，不得有凝块，尽快分离血浆，将标本4℃以3000 r/min离心15 min，取上层血浆。血浆于-80 ℃冰箱保存2周，测定前37℃快速融化，轻微混匀后使用全自动凝血分析仪和试剂盒检测。凝血指标包括有凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplatin time, APTT)、纤维蛋白含量（fibrinogen，FIB）。

2.6 WB法测定小鼠脑组织中ICAM1和VCAM1的表达水平

提取细胞总蛋白：每组样本三个重复共5组，从-80 ℃冰箱中取出组织，4℃液氮进行研磨，取1.5 mL离心管预冷后进行称重，按照10% RIPA裂解液进行组织裂解30 min，4℃离心12000 rpm，取上清进行蛋白定量及- 80℃保存。蛋白定量：按照BCA说明书进行蛋白浓度测定，配好标准液，对样品上清需要稀释10倍后进行测定，在96孔板中加入25μL样品或标准液，再加入200 μL的工作液，37℃孵育30 min。利用酶标仪测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。最终各样品蛋白浓度按照测定结果用裂解液进行调整。

制备10%分离胶10mL，其中需要双蒸水4 mL、30%丙烯酰胺(Acr) 3.3 mL、1.5mol/l Tris-Hcl（pH8.8）2.5 mL、10% SDS 100 µL、10% APS 100 µL、TEMED 4 µL。将双蒸水、30%丙烯酰胺（Acr）、1.5mol/L Tris-Hcl（pH8.8）、10 % SDS混匀，加入10 % APS，轻轻混匀，TEMED在注胶前再加入，轻摇混匀不出泡即可，否则凝结无法注胶。

制备5%的浓缩胶5 mL，其中双蒸水3.4 mL、30 %丙烯酰胺（Acr）0.83 mL、1.0 mol/L Tris-Hcl（pH6.8）0.63 mL、10 % SDS 50 µL、10 % APS 50 µL、TEMED 5 µL。混合顺序如分离胶操作。将5%浓缩胶快速注入电泳槽两玻璃板之间，迅速将样品孔梳平平插入浓缩胶中，直至梳子齿底部与前玻璃板的顶端平齐，避免产生气泡。室温静置45 min以上。

蛋白变性和电泳：将5×SDS-PAGE上样缓冲液loading buffer与蛋白样品按1:4混匀，95 ℃水浴锅中加热5 min，冷却至室温，离心5 min，取上清，分装，-20 ℃保存备用。电泳液没过胶板，浓缩胶聚合后拔出样品梳，用微量注射器将蛋白样品注入上样孔中。Marker 在边缘孔加入约5 μL即可。以恒压（浓缩胶80V，分离胶120V）方式电泳，当溴酚蓝指示剂达到分离胶底部前1 cm时，停止电泳。

进行转膜前先按照胶的大小裁好PVDF膜，将PVDF膜在甲醇中浸泡活化，海绵和滤纸一同浸泡。待电泳结束后，开始湿法转膜。将夹子打开，在上面垫一张海绵垫、三层滤纸，将分离胶和PVDF膜盖于滤纸上，PVDF膜在上，分离胶在下面。再将另三张滤纸盖于PVDF膜上，盖上海绵垫，中途注意除气泡，扣紧夹板，迅速将其放入转膜槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。加入预冷的转膜缓冲液。转膜槽冰水浴使其尽量保持在4 ℃，120 mA恒流转移2 h。

取出PVDF膜放入事先配制好的封闭液（含5 %脱脂奶粉的TBST溶液）中，摇床上室温封闭孵育2 h。封闭后直接加入目的蛋白的一抗，按照1:1000使用TBST稀释，置于摇床上室温孵育约1 h后，4℃孵育过夜。次日，TBST孵育3次，每次10 min，加入对应的二抗（按照1:5000稀释）中，室温孵育2 h。孵育结束后，用TBST洗3次，每次10 min。将A和B液1:1混合，滴加于PVDF膜，膜正面朝上放入成像系统的暗箱中，用凝胶成像系统进行扫描、拍片。

2.7数据处理方法

所有数据均以每组的平均值±SEM表示，统计数据通过单因素方差分析和非参数检验，随后使用Dunnett´s多重比较检验，使用Graphpad Prism 5.0版进行图表及统计分析，p<0.05显示有统计学意义，*p<0.05, **p<0.01 ***p<0.001。

（二）进一步研究青蒿琥酯川芎嗪组合对ECM药效作用机理

1材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物和疟原虫株

同第一部分1.1.1

1.1.2 实验试剂

Giemsa染液，批号SLBT6353，Sigma 公司；

AS，批号C00220171106，重庆华方武陵山制药有限公司；

盐酸TMP注射液，批号P18050701，北京永康药业有限公司；

钆喷酸葡胺注射液，国药准字H20153167，江苏恒瑞医药股份有限公司；

亚硝基化蛋白检测试剂盒，批号1000651-8，Cayman；

NO检测试剂盒，批号ab65328，abcam；

10×电泳液，批号：B1006，北京普利莱基因技术有限公司；

BD脱脂奶粉，批号：6342932，比迪医疗器械（上海）有限公司；

超敏ECL化学发光试剂盒，批号：P0018，碧云天公司；

ZO-1兔多克隆抗体，21773-1-AP，Proteintech；

eNOS抗体，ab76198，Abcam；

iNOS 兔多克隆抗体，18985-1-AP，Proteintech；

nNOS抗体，ab1376，Abcam；

Pdhb，14744-1-AP，Proteintech；

Lnpk，NBP2-75557，Novus Biologicals。

1.1.3 实验仪器

血流灌注成像仪 PeriCam PSI System, Perimed, 瑞典

酶标仪 Multiskan MK3，Thermo Fisher Scientific公司

电泳仪 型号 1645050，Bio-Rad伯乐公司

凝胶成像系统 购自普诺森生物科技（上海）有限公司

透射电子显微镜TEM，型号HT7700，HITACHI公司

小动物核磁共振谱像系统，型号BioSpec70/20USR，德国Bruker

AKTA Purifier100色谱分级系统

Q-exactive质谱仪

1.1.4 药物配制

同第一部分1.1.4。

1.2 脑血流测定

采用激光散斑对比分析(LASCA)技术的血流灌注成像仪对脑血流进行评估。在D7时，各组小鼠（n=6）腹腔注射三溴乙烷麻醉。小鼠脑部脱毛并剪开表层头皮，暴露出脑， 定位脑的中线和人字缝位置后进行测定。采用PSI扫描，实时记录3 min内血流灌注的动态及空间分布。每组收集6只小鼠的图像和数据。脑血流以任意单位(灌注单位，PU)表达。

1.3 MRI测定

在D8时，在开始麻醉前15 min对每组小鼠尾静脉注射剂钆特酸葡胺0.1mL，使用三溴乙醇腹腔注射，待麻醉后将其如成像暗箱内，并使用控制软件对小鼠进行扫描定位，确定合适位置。用小动物核磁共振成像系统进行T1、T2和DCE-FLASH扫描。T1、T2扫描时视野区域为20×20 cm2，采集的矩阵为256×256，TR=3300，TE=35，NEX=2.0，成像时间02:12，FA=90.0；DCE-FLASH，TR=12.0，TE=1.49，NEX=3.0，成像时间04:43，FA=30.0。

1.4 NO水平测定

D7时各组小鼠（n=6）取脑和血清按照说明书使用一氧化氮检测试剂盒，型号为Nitric Oxide Assay Kit (Colorimetric) (ab65328)进行检测。脑组织匀浆后和血清一样，使用10 kD Spin Columns (ab93349)进行脱蛋白处理，按照硝酸盐作标准曲线，各组按照说明书要求进行加样和孵育，最终使用酶标仪进行OD540检测。

1.5 WB法测定蛋白表达

具体方法同第一部分2.6，每种一抗按照1:1000进行稀释。

1.6 电镜（TEM）

取材固定：取新鲜组织各组小鼠大脑皮层，利器切成块，投入电镜固定液，室温固定2 h 后4℃保存。PBS漂洗3次，每次15 min。1%的锇酸·0.1M磷酸缓冲液PBS（pH7.4）室温（20℃）固定2 h。PBS漂洗3次，每次15min。

脱水、渗透：组织依次入梯度乙醇-100%丙酮上行脱水，每次15 min。丙酮:812包埋剂=1:1，4 h包埋，丙酮:812包埋剂=1:2渗透过夜，纯812包埋剂5-8 h进行包埋，将纯812包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后37℃烤箱过夜。

包埋切片：60℃烤箱聚合48 h。超薄切片机切片60 nm超薄切片。

染色分析：铀铅双染色（2%醋酸铀饱和酒精溶液，枸橼酸铅，各染色15 min，切片室温干燥过夜，继续在TEM下观察，采集图像分析。

1.7 亚硝基化蛋白提取

在D7进行冰上取脑（n=3），使用动物总蛋白提取试剂盒（invent）自然裂解液SN-002进行总蛋白提取操作，BCA蛋白定量，统一各组每个样品蛋白浓度。使用亚硝基化蛋白试剂盒对亚硝基化的蛋白进行生物素标记，取每样本20ul用以进行WB蛋白检测亚硝基化总体蛋白量表达。剩余全部亚硝基化处理的蛋白使用亲和素琼脂糖微株使用rotater 4℃孵育过夜，第二天使1%SDS（PBS）、0.16 %SDS（PBS）、PBS洗三次，离心去上清。进行pull down操作后，保存在-80℃，准备进行后续label free蛋白质谱定量。

1.8亚硝基化蛋白电泳

每个样品蛋白分别与5X上样缓冲液混合，95℃煮沸5 min，在SDS-PAGE凝胶(恒流14 mA, 90 min)上分离。考马斯亮蓝Blue R-250染色可见蛋白条带。

1.9亚硝基化蛋白质谱-相对定量Label free法

蛋白质提取和肽段酶解：五组样品（n=3）采用 SDT（4%(w/v) SDS, 100 mM Tris/HCl pH7.6, 0.1M DTT）裂解法提取蛋白质，然后继续采用 BCA 法进行蛋白质定量。每个样品取适量蛋白质采用 Filter aided proteome preparation (FASP)方法进行胰蛋白酶酶解，采用 C18 CASridge 对肽段进行脱盐，肽段冻干后加入 40 μL0.1%甲酸溶液复溶，肽段定量（OD280）。

HPLC：每份样品采用纳升流速的 HPLC 液相系统 Easy nLC 进行分离。缓冲液 A 液为 0.1%甲酸水溶液，B液为 0.1% 甲酸乙腈水溶液（乙腈为84%）。色谱柱以 95%的 A 液平衡，样品由自动进样器上样到上样柱（Thermo Scientific Acclaim PepMap100, 100 μm×2 cm, nanoViper C18），经过分析柱（Thermo scientific EASY column, 10 cm, ID75 μm, 3 μm, C18-A2）分离，流速为 300 nL/min。

LC-MS/MS：样品经色谱分离后用 Q-Exactive 质谱仪进行质谱分析。检测方式为正离子，母离子扫描范围 300 -1800 m/z，一级质谱分辨率为 70,000 at 200 m/z，AGC(Automatic gain control) target 为 1e6，Maximum IT为 50 ms，动态排除时间（Dynamic exclusion）为 60.0 s。多肽和多肽碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描（full scan）后采集 20 个碎片图谱（MS2 scan）， MS2 Activation Type 为 HCD，Isolation window 为 2 m/z，二级质谱分辨率 17,500 at 200 m/z， Normalized Collision Energy 为 30 eV。

蛋白质鉴定和定量分析：质谱分析原始数据为RAW文件，用软件 MaxQuant 软件（版本号1.5.3.17）进行查库鉴定及定量分析。相关参数和说明如下：Enzyme=Trypsin，Max Missed Cleavages（允许的最大漏切位点数目）=2，Fixed modifications(固定修饰)=Carbamidomethyl (C), Variable modifications(可变修饰)=Oxidation (M) , Main search（一级离子质量容差) =6 ppm，First search（预检索一级离子质量容差) =20ppm，MS/MS Tolerance (二级离子质量容差) =20 ppm，Database（查库所使用的数据库=Swissprot_Mouse，protein FDR（可信蛋白质的筛选标准）≤0.01，Peptide FDR（可信肽段的筛选标准）≤0.01，protein quantification（蛋白质定量算法）=LFQ/iBAQ。

1.10亚硝基化蛋白质谱生物信息分析

差异蛋白分析 按照p<0.05和差异倍数大于1.2（Control组与M组）或1.5（TMP组、AS与AS+TMP组）对于所有检测到的亚硝基化蛋白进行差异蛋白分析，其中还包括在两组比较中一组出现两次而另一组未出现的，属于差异蛋白表达。

GO注释 使用 Blast2GO 对目标蛋白集合进行GO注释，过程大致可以归纳为序列比对（Blast）、GO条目提取（Mapping）、GO注释（Annotation）和 InterProScan 补充注释（Annotation Augmentation）等四步。

KEGG注释 使用 KAAS (KEGG Automatic Annotation Server) 软件，通过KEGG数据库对目标蛋白质集合进行 KEGG 通路注释。

GO和 KEGG的富集分析 采用 Fisher 准确检验（Fisher’s Exact Test），总体比对各个GO分类或KEGG通路在目标蛋白质集合和总体蛋白质集合中的分布情况，对目标蛋白质集合进行GO注释或KEGG通路注释的富集分析。

蛋白质聚类分析 首先对目标蛋白质集合的定量信息进行归一化处理（归一化到（-1,1）区间）。然后，使用Complexheatmap R 包（R Version 3.4）同时对样品和蛋白质的表达量两个维度进行分类（距离算法：欧几里得，连接方式：Average linkage），并生成层次聚类热图。

蛋白质相互作用网络分析 基于 STRING（http://string-db.org/）数据库中的信息查找目标蛋白质之间的相互作用关系，并使用 CytoScape 软件（版本号：3.2.1）生成相互作用网络并对网络进行分析。

1.11亚硝基化蛋白质谱蛋白验证

蛋白验证选择：在五组差异蛋白表达中选择多组之间存在的交集；WB分析：同第一部分2.6。

3.1接种疟原虫对小鼠生存率与原虫血症的影响

由图1可见，空白组小鼠生存率为100%，模型组小鼠接种第9天开始出现死亡，至第16天已全部死亡。原虫血症从接种第3天开始增长，第7天趋于平缓，在7至11天原虫血症小于30%，第11天后继续增长，至第15天，原虫血症仍低于50%。

图1 实验小鼠生存率和原虫血症水平变化

3.2接种疟原虫对小鼠的体重变化影响

由图2可见，空白组小鼠体重整体趋势平稳，而模型组小鼠体重整体呈下降趋势。接种前5天两组体重未见明显差异且第5天空白组小鼠体重与模型组小鼠体重相当(19g)，第5天后，模型组小鼠体重急剧下降，至第10天，模型组体重仅为14g，第11天体重虽有所增长，但结合生存率曲线考虑是由于低体重小鼠死亡后不计入体重统计造成的整体均值增大，至接种第15天，模型组小鼠体重已接近12g。

图2 实验小鼠体重水平变化

3.3接种疟原虫对小鼠 RMCBS 得分的影响

由图3可见，模型组小鼠接种后RMCBS得分整体呈下降趋势，至第17天，分数趋于0，空白组得分较为平稳，观察期内持续维持在14分左右。接种第4天，RMCBS得分出现下降，结合原虫血症曲线可发现此时小鼠体内已可观察到存活的疟原虫。至接种第11天，RMCBS评分已低于5分，此时小鼠进行RMCBS评分时在检测盒内探索角落小于2个，耳廓反射和脚趾反应在重复的三次测试中仅有一次或两次有反射，小鼠趋于死亡时（出现抽搐，昏迷）RMCBS得分为“0”。

图3 实验小鼠RMCBS得分变化

3.4实验小鼠微血管阻塞情况评价

病理结果显示正常小鼠海马、小脑组织结构轮廓清晰，细胞结构正常，排列有序，未见炎症细胞浸润，未见组织水肿。而模型组小鼠海马CA1区可见神经元锥体细胞固缩深染，组织中部分血管内可见白细胞聚集；部分血管内皮层剥脱，和组织之间形成间隙；部分海马锥体细胞变性，细胞浓缩、深染。如图4所示，通过HE染色发现，正常组海马血管未见阻塞，而模型组海马血管内可见感染疟原虫红细胞及粘附白细胞，此外，小脑组织 HE 染色发现模型组有脑出血存在。

图4 HE染色观察实验小鼠血管堵塞和出血情况

3.1青蒿琥酯川芎嗪组合对于ECM小鼠主要药效作用的影响

本实验为了探索青蒿琥酯川芎嗪联合用药药效，分为5组（n=10），分别有Control组、M组、TMP(10.4 mg/kg)、AS（7.8 mg/kg）和AS+TMP组（7.8 mg/kg和10.2 mg/kg），比较这几组对于ECM小鼠的药效作用。

3.1.1青蒿琥酯川芎嗪组合对于ECM小鼠生存率的影响

Control组至观察终止，组内小鼠无死亡；M组小鼠在D7开始出现死亡，死亡率60 %，至D9死亡率达100 %；TMP组从D7开始出现死亡小鼠，死亡率为30 %，至D10死亡率达100 %； AS组D11出现小鼠死亡，至观察终止存活率为70 %；AS+TMP组D11开始出现死亡，至观察终止，组内存活率为80 %。使用log-rank检验显示Control组、AS和AS+TMP组均与M组存在显著的统计学差异（p<0.001），而在AS与AS+TMP组之间没有统计学差异，如图1所示。结果表明AS组与AS+TMP组均能够显著提高ECM小鼠生存率，AS组与AS+TMP组间没有统计学差异。

图1 各组小鼠生存曲线情况。

3.1.2 青蒿琥酯川芎嗪组合对于ECM小鼠感染率的影响

M组与TMP组在D7时死亡较多，且小鼠严重贫血，健康状况极差，故对各组感染率统计至D7。与M组在D7感染率（39.01±4.181）相比，AS（15.19±2.895）和AS+TMP组（10.94±1.469）D7感染率显著降低（p<0.001），TMP组（32.46±4.917）D7感染率与M组无统计学差异，如图2结果显示，AS+TMP组能够有效降低小鼠的感染率。

图2 各组对ECM小鼠感染率的影响。***p<0.001，表示与M组相比的统计结果

3.1.3青蒿琥酯川芎嗪组合对于ECM小鼠体重的影响

对小鼠体重的统计显示，M组小鼠与TMP组小鼠在D5开始呈明显下降趋势，对D7小鼠体重进行分析显示，如图3，与Control组相比（17.71±0.279），M组（14.18±0.368）体重明显下降（p<0.001）；与M组相比，AS（15.97±0.230）和AS+TMP组（16.72±0.233）体重水平显著增长（p<0.001），而TMP组（14.84±0.380）与M组没有统计学差异。对于体重的统计结果表明了AS和AS+TMP组均能够对小鼠在ECM发生时明显的体重降低有所改善。

图3各组小鼠体重的影响。*p<0.05， ***p<0.001表明与M组相比，下同

3.1.4 青蒿琥酯川芎嗪组合对ECM小鼠RMCBS的影响

在D5时，M组小鼠开始出现探索能力下降、四肢力量减弱、走路不稳等症状，D6开始，脑型疟症状加重，RBCBS得分迅速下降，小鼠明显出现步态不稳、平衡性下降、活动减少、背部拱起，四肢力量开始明显减弱、进攻行为减弱，皮毛不顺甚至立毛等现象， ECM小鼠会丧失进攻行为，触摸时反应不灵敏甚至无反应，共济失调，耳廓反射减弱或消失，脚趾反射减退。在D7时， Control组（19.9±0.10）、TMP组（14.60±0.733）、AS（17.30±0.396）和AS+TMP组（18.90±0.379）在RMCBS上明显高于M组（11.30±0.597）评分（p<0.001），M组RMCBS评分已经下降到13以下。结果表明，青蒿琥酯川芎嗪组合能够明显的对ECM小鼠的行为学如共济失调、活动减少、卫生行为、脚趾反射消失、昏迷和偏瘫等症状有明显的改善作用。

图4 各组对ECM小鼠RMCBS的影响。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001表明与M组相比

3.2 HE染色检测青蒿琥酯川芎嗪组合对于ECM小鼠脑部病理情况

如图5，对各组小鼠大脑皮层、海马、小脑及嗅球进行HE染色，结果显示Control组小鼠脑组织有清晰的细胞结构，未见炎性细胞浸润，也未见水肿现象，脑内微血管未见阻塞；而在M组小鼠大脑存在明显的疟色素沉淀，大脑微血管内可见大量淋巴细胞及pRBC聚集，脑组织间隙增大，部分区域发生水肿，AS、TMP组血管内也可见pRBC，AS+TMP给药后显著减少了淋巴细胞及pRBC的粘附；Control组海马区细胞排列有序，M组海马CA1区可见部分神经元细胞皱缩、深染，AS、TMP组可见个别神经元皱缩，AS+TMP组极少见神经元细胞皱缩现象；Control组的小脑和嗅球组织细胞排列正常，未见出血灶，M组小鼠嗅球小脑部位可见较多出血及疟色素，AS、TMP组有少量出血灶，而在AS+TMP组极少见出血灶。

图5 HE染色观察AS、TMP和AS+TMP对于ECM小鼠和正常小鼠脑部情况

3.3尼氏染色检测青蒿琥酯川芎嗪组合对于ECM小鼠脑部情况

尼氏染色主要是根据神经元内部大量的嗜碱性尼氏小体能够被碱性染料染色，尼氏体呈块状或颗粒状。实验结果显示，如图6，Control组小鼠海马区细胞排列整齐、细胞形态正常，同时胞核清晰、胞质均匀，尼氏小体多而大；M组小鼠海马区细胞形态不规则，细胞完整性被破坏，胞核皱缩，尼氏小体数量相较Control组明显减少，且排列较为紊乱；在AS、TMP组，尼氏小体数量相对增加，在AS+TMP组，相比较M组，尼氏小体数量多且大，尼氏染色实验结果显示M组神经元存在一定程度的损伤，AS、TMP组和AS+TMP组一定程度上能够改善其神经元损伤情况。

图6 尼氏染色观察AS、TMP和AS+TMP对于ECM小鼠和正常小鼠神经元情况

3.4 FJB染色观察青蒿琥酯川芎嗪组合对于ECM小鼠神经细胞凋亡情况

Fluoro-Jade® B（FJB）染色主要针对退化神经元显色；在健康小鼠大脑中没有特异性荧光染色：FJB（绿色荧光），使用蓝光或者488 nm激光激发，FITC通道检测（Ex/Em=495/521nm）,使用DAPI标记细胞核。如图7显示，相比较Control组小鼠绿色荧光阴性表达，在M组小鼠脑部的海马CA1区染色后可见大量阳性绿色荧光的退化神经元，呈固缩状，且排列混乱；AS、TMP组仍有少量呈阳性的退化神经元，AS+TMP组则几乎不可见绿色荧光的神经元，显示AS+TMP组相比较M组退化神经元减少。

图7 FJB染色观察各组小鼠退化神经元情况

3.5检测青蒿琥酯川芎嗪组合对ECM小鼠凝血水平

使用全自动凝血分析仪检测了各组小鼠在D7时凝血指标（n=6），包括有凝血酶原时间PT、活化部分凝血活酶时间APTT及纤维蛋白含量FIB三项。如图8显示，相比较Control组的PT值（12.15±0.6627），M组PT值（23.60±4.866）要明显升高（p>0.01）；与M组相比，TMP组、AS和AS+TMP组的PT值均降低，其中AS和AS+TMP组明显降低（p<0.05）；APTT在M组（38.20±2.181）和control组（36.18±4.714）无统计学差异，与TMP组（40.50±5.727）、AS（35.73±5.824）和AS+TMP组（26.80±3.834）均没有统计学差异。

图8 凝血分析仪测定各组小鼠的PT、APTT和FIB值

3.6 WB分析法测定小鼠脑组织中ICAM1和VCAM1的表达水平

通过WB法对各组小鼠脑部的粘附因子受体ICAM1和VCAM1水平进行半定量分析，如图9，结果显示与Control组相比， M组中ICAM1明显较高（p<0.01）；与M组相比，AS和AS+TMP组ICAM1表达水平较低（p<0.05）；M组VCAM1表达水平显著高于Control组（p<0.05），AS+TMP组VCAM1表达水平显著低于M组（p<0.05），其他组与M组相比，VCAM1表达水平无统计学差异。

图9 WB检测各组小鼠脑内ICAM1和VCAM1表达情况

4 讨论

从中医的角度出发，恶性疟疾属于瘴疟，预后差且易导致死亡；疟病日久，气机郁滞，血脉瘀滞，气滞血瘀。中药川芎，能够活血化瘀又能行气止痛，在蒙药中记载能够鼻塞截疟，上行可达巅顶，治疗多种头痛包括血瘀头痛。川芎中的重要生物碱成分TMP，可治疗脑梗、脑缺血等，在古籍中记载能够治疗神经性脑部疾病，前期有研究发现TMP在经鼻给药时能够明显提高其治疗的药效。实验室前期将药物AS和TMP联合给药，使用滴鼻给药的方法，发现其在常规4天给药的条件下，能够显著降低小鼠的原虫血症水平，相比较于单用AS，联合给药能够缓解小鼠昏迷或是焦虑等行为学表现。本研究将进一步的对青蒿琥酯川芎嗪组合组，探讨其对ECM小鼠保护作用和药物的作用机制。

关于CM的治疗方法，WHO推荐的一线疗法主要是静脉注射AS，青蒿素类注射剂起效快、疟原虫清除彻底和毒副作用小。AS在体内迅速转化为双氢青蒿素，体内主要作用形式为双氢青蒿素。WHO最新指南中指出由于疟原虫对AS的敏感度在下降，因此AS的使用剂量明显加大（从原来的成人首剂120 mg，继续60 mg持续7天改为每日连续给药2.4 mg/kg，给药7天）。

流行病学统计发现CM在高原虫血症（>5 %）、滋养体和裂殖体期疟原虫占比（占比> 20 %）、红细胞压积过低、血红蛋白异常、低血糖、肌肉酶升高等因素时会发生预后不良，如死亡和神经系统疾病等。当预后不良因素较多时单一使用抗疟药物难以控制CM导致的不良预后事件，因为CM导致神经元损伤不可逆，且较多辅助疗法药物都因为各种原因失败了，迫切需要CM发生时改善其不良预后的药物。

AS+TMP联合给药组沿用实验室前期研究时使用的比例为AS：TMP为1:0.75，两种药物的总剂量为18.2 mg/kg，使用滴鼻给药，AS按照药典青蒿琥酯注射剂使用的方法进行配制，药物符合滴鼻给药制剂的初步要求如PH值、渗透压等。关于其剂型的制备，还会有进一步的完善与配方的调整。

由于血脑屏障(BBB)的存在，药物向大脑的递送困难。经鼻给药是一种有效和可靠的替代口服和非肠道给药途径，可替代传统的脑室内注射，直接向中枢神经系统递送药物，有效地绕过BBB。前期已有研究证明了青蒿琥酯[35]及川穹嗪[36]单独给药时能够通过鼻粘膜进入脑部，穿过血脑屏障发挥其作用，而实验室内对其进行静脉注射给药进行对比评价时也证明了滴鼻给药的生物利用度[35]。AS在体内会迅速转化为双氢青蒿素，在体内发挥作用的主要为双氢青蒿素，滴鼻给药时双氢青蒿素和TMP在ECM脑内脑脊液中有效浓度较高，生物利用度较高，杀虫效果和保护脑血管作用均较好，前期实验室研究结果也显示了滴鼻给药顺应性好且杀虫效果与静脉给药相近。

2.1 脑血流测定

对各组小鼠脑部血流灌注的测定，显示各组小鼠脑部血流情况包括在脑部大血管及嗅球等部位血流灌注量情况，红色显示其血流充足，黄色至蓝黑色显示灌流量较低。在ECM发生时，M组（160.3±25.80）相比起Control组小鼠（241.7±24.69）脑部血流灌注量明显减少（p<0.001），其脑部各血管均显示灌注量不足，小微血管明显灌注不足，红色区域较少，且对其脑部两侧比较，显示大脑两侧血流灌注不同；而相比起M组，在TMP组（194.7±15.27）脑部血流灌流量增加（p<0.05），在嗅球部分和脑部大血管显示灌流量相对增加，在AS（217.1±34.04）脑部血流灌注情况明显好转（p<0.001）；在AS+TMP组（254.6±24.56）脑部血流灌注量同样显著增加（p<0.05），从平均灌流量看，红色区域明显增加，如图10。

图10激光散斑血流仪检测各组小鼠脑血流结果，其中A为各组脑血流测定结果；图B为各组脑血流平均灌注量情况（perfusion，PU）（n=6，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001）

2.2 脑部核磁MRI结果

对各小组小鼠进行核磁T2扫描中，使用拟色法分析，深蓝色显示信号强度低，而亮黄色显示信号强度高，各组小鼠以眼眶的信号强度为基准来调节其显色。与Control组相比，M组出现了明显的信号强度减小的现象，而与M组相比，TMP组、AS和AS+TMP组信号强度均增强。铁离子沉积会使得受影响组织信号强度降低，减低程度与铁沉积量有关。如图11，M组在大脑皮层的大部分位置信号的降低则显示了铁色素大量沉积于脑部，M组出现了铁沉积现象，在TMP和AS组中，也存在小部分的铁沉积，而在AS+TMP组与Control组中，几乎不存在铁沉积的现象。当出现组织局部出血或瘀血时，T2的信号强度会减小，由图中11显示M组小鼠的嗅球部位，出现了明显的弱信号（左右都有），M组嗅球部位发生出血现象；而在Control组和各给药组中，嗅球部位均为强信号，显示没有明显的嗅球出血现象，由MRI的T2检测证明了M组小鼠在ECM时会发生脑部的铁沉积与嗅球出血现象，而AS、TMP和AS+TMP组均能够改善其病理症状，其中AS+TMP组能够明显改善铁沉积及嗅球出血的症状。

图11 MRI使用T2扫描检测各组小鼠脑部情况

各组小鼠固定时间前进行血管造影后进行MRI检测，根据造影剂的代谢速度与造影情况检测小鼠微血管的灌流情况与微血管形态等。由图12可得，Control组小鼠代谢造影剂速度正常，脑微血管形态正常；M组脑血流速度减慢，因此造影剂在脑内大血管滞留，而并非像Control组与给药组那样已经流动至小血管及微血管。对各组微血管形态进行观察显示，M组与其他组比较而言，脑部的微血管及小血管较为稀少，在TMP、AS和AS+TMP组脑血流流速和流量明显有所增加，AS+TMP明显改善脑部的血流情况，且小微血管较多，血管形态较为正常，如图12。

图12 MRI使用血管造影检测各组小鼠脑血管情况

2.3 ZO-1蛋白表达情况及TEM结果

ZO-1作为血脑屏障相关蛋白，在血脑屏障中占有重要作用，相比较Control组小鼠蛋白表达水平，在M组小鼠ZO-1表达明显减少（p<0.01）；比起M组AS+TMP组后明显增加了ZO-1的表达（p>0.01）。

各组小鼠皮层的电镜结果，如图13显示：M组小鼠血脑屏障结构局部连接松散，相邻内皮细胞间紧密连接（TJ）数量较少，细胞间隙略微增宽；基底膜（BM）完整、无明显断裂，中度复层化。内皮细胞（En）中度水肿，线粒体（M）大部分轻度肿胀、嵴断裂，少部分内外膜局部破损；粗面内质网（RER）轻微扩张；终足（Ast）严重水肿；毛细血管腔（Cap）严重受压。

TMP组和AS血脑屏障结构完整，相邻内皮细胞间可见清晰的紧密连接（TJ），呈连续条带状，TMP组连接紧密而AS连接平滑，局部模糊；两组均基底膜（BM）完整、清晰、无明显断裂，厚薄均一而AS存在轻微复层化。TMP组内皮细胞（En）轻微水肿，线粒体（M）中度肿胀、嵴断裂减少；粗面内质网（RER）轻微扩张；终足（Ast）轻度水肿；毛细血管腔（Cap）无明显受压。AS内皮细胞（En）中度水肿，线粒体（M）严重肿胀、空泡化、嵴消失；粗面内质网（RER）轻微扩张；终足（Ast）中度水肿；毛细血管腔（Cap）轻度受压。

AS+TMP组血脑屏障结构较完整，相邻内皮细胞间可见清晰的紧密连接（TJ），呈连续条带状，无明显断裂，连接紧密；基底膜（BM）完整、清晰、无明显断裂。内皮细胞（En）轻度水肿，线粒体（M）中度肿胀、嵴断裂减少；粗面内质网（RER）轻微扩张；终足（Ast）中度水肿；毛细血管腔（Cap）无明显受压。

综上各组分析可得，AS+TMP组和TMP组终足水肿程度较另外两组低，且血管腔受压不明显，前者内皮水肿程度略低于后者； AS终足大半面积严重水肿，血管腔轻度受压，内皮细胞轻度水肿；而M组血脑屏障存在部分紧密连接松散，终足严重水肿，血管腔严重受压变形，较其它三组最严重，内皮细胞中度水肿。

图13 WB检测各组小鼠脑部ZO-1蛋白表达及大脑皮层电镜情况

2.4 NO水平检测

检测在脑组织和血清的一氧化氮水平（n=6），结果如图14：ECM发生时M组小鼠血清NO（4.317±2.088）与正常小鼠血清NO（23.59±3.546）相比，NO含量明显减少（p<0.05）；与M组相比， AS（18.64±5.853）NO含量明显升高且有统计学意义（p<0.05），AS+TMP组（25.31±2.898）比起M组NO明显升高（p<0.01），而TMP组（16.26±3.840）无统计学意义。

各组小鼠脑内NO检测结果分析显示，M组脑部NO（1.314±0.3653）与正常小鼠脑部NO（2.452±0.7584）相比，ECM发生时小鼠脑内NO含量明显减少（p<0.01）；与M组相比，TMP组（1.757±0.5374）、AS（1.407±0.4685）和AS+TMP组（2.174±0.4262）脑组织NO明显增加，其中TMP组相比起M组升高（p<0.01），AS+TMP组脑组织NO水平显著升高（p<0.001），差异具有统计学意义。

图14各组小鼠血清和脑部NO水平检测结果

2.5 NOS水平测定

使用WB法检测一氧化氮合酶的三种亚型：内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、神经元型一氧化氮合酶（nNOS）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）。取各组小鼠在D7时脑组织进行检测（n=3），每组三个样品，并使用imageJ进行半定量分析。

如图15分析结果，ECM发生时nNOS水平在M组脑部的表达比起Control组显著减少（p<0.05）, nNOS在TMP组和AS与M组相比没有统计学差异，AS+TMP组与M组相比显著增加（p<0.01）；eNOS在M组脑部的表达比起Control组显著减少（p<0.05）；TMP组与M组相比表达增多（p<0.05），而AS与M组相比没有明显差异，AS+TMP组相比起M组，明显增加了eNOS的表达（p<0.01）。在ECM发生时iNOS表达，虽然M组相对较高却并没有统计学差异，其他各组与M组也没有统计学差异。

图15各组小鼠脑部NOS亚型WB检测结果

2.6 蛋白亚硝基化水平测定

各组小鼠脑部进行总蛋白提取后，使用亚硝基化试剂盒（批号1000651-8，Cayman）对亚硝基蛋白进行标记，使用试剂盒内一抗检测各组亚硝基蛋白。结果如图16，图A为考马斯亮蓝检测结果；图B为一抗检测结果；A图显示总量上M组亚硝基蛋白较少，而各给药组TMP、AS和AS+TMP组亚硝基蛋白表达均增加；B图显示具体各组的亚硝基化蛋白表达不同，与M组相比Control组、AS和AS+TMP组没有明显的差异，而TMP组亚硝基蛋白水平明显增加。

图16各组小鼠脑部亚硝基化蛋白情况WB检测结果

2.7 亚硝基化蛋白质谱结果

2.7.1 Control组与M组（C/M）的差异蛋白及分析

首先对于Control组与M组（C/M）进行蛋白组学分析。在两组中共检测到共鉴定到了917个亚硝基化的蛋白，在Control组与M组对比后得到了1.2倍的差异蛋白共有45个，其中上调有21个，下调有24个。其中表达差异较大在M组上调蛋白有血红素结合蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂、转铁蛋白、载脂蛋白A1、天冬酰胺-tRNA连接酶等，下调蛋白有血红蛋白α亚基、40S核糖体蛋白 S19、乙酰辅酶A乙酰转移酶、热休克蛋白105 kDa、磷酸丙糖异构酶等。

将差异蛋白进行了聚类热图分析，M组和Control组之间差异蛋白的聚类情况（图17，A）纵列显示样本大家可以明显的看到，两条目，如C1、C2、C3为Control组的三个样本，M1、M2、M3为M组的三个样本；在两组的差异蛋白总体表达中，明显呈现出较大差异：在Control组中，存在明显大致相等的蛋白上调表达（红色）和下调表达（蓝色），而M组则与其表达正好相反。属于正常的三个样本（C1、C2和C3）的表达模式相近， M组的三个样本（M1、M2和M3）相近显示各自的样本重复性较好，得出的数据也是可信的。进一步（如图17，B）将其进行了GO功能富集，发现其top20在细胞部分（cellular component，CC）的条目有：细胞外泌体、线粒体、血液微粒、一级树突、细胞质、髓鞘、内质网等，生物过程（biological process，BP）中富集到了物质代谢过程、转运体、蛋白折叠、铁转运和对ROS反应等；分子功能(molecular function，MF)中有相关的蛋白连接、催化活性和分子伴侣这些条目上。

在C/M组中，将差异蛋白进行了通路富集分析（如图17，D），发现通路会涉及到碳代谢和糖酵解、生物合成抗生素、HIF-1通路、丙氨酸代谢、色氨酸代谢、脂肪酸降解、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸多种氨基酸的代谢异常，解除对NMDA受体的阻断、谷氨酸结合和激活（R-MMU-438066），血浆中清除血红素通路（R-MMU-2168880），血小板脱颗粒（R-MMU-2168880）。

在差异蛋白进行蛋白互作分析（protein protein interaction，PPI）时（如图17，C），最终得分值（degree）较高中涉及到的关键酶有乙酰辅酶a乙酰转移酶、磷酸丙酮异构酶、谷氨酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶E1、Enoyl-CoA水合酶、电子传递黄素蛋白-泛醌氧化还原酶、钠/钾运输ATP酶相比较起Control组，M组亚硝基化水平均明显降低，而亚硝基化过后这些酶的活性是减弱的，说明在脑内糖代谢和氨基酸代谢加快，脂肪酸降解，线粒体功能异常。

图17 M组和C组亚硝基化蛋白的差异分析结果

2.7.2 M组与TMP组的差异蛋白及分析

在M组与三给药组（TMP组、AS和AS+TMP组）中，共检测到了1862个蛋白。M组与TMP组（TMP/M）共有244个差异蛋白进行分析，其中上调蛋白有81个，下调有163个。其中在差异倍数较大与M组相比上调蛋白有脂阀结构蛋白2、突触核蛋白α、钙调磷酸酶B、E3 泛素连接酶 RBX1、细胞色素b-c1复合体，下调有脑一氧化氮合酶、粘附G蛋白偶联受体L1、piccolo蛋白、NADP依赖性苹果酸酶、肌酸激酶M型等。

对M组与TMP组之间差异蛋白进行GO富集，通路分析及蛋白互作分析（PPI），结果如图18。首先对M组和TMP组三样本使用聚类热图分析（图18，A）来显示各自的差异蛋白具有较为明确差异，质谱的数据较为可信。然后进行的GO富集（图18，B）在BP上的条目主要有突触组装、B细胞分化、细胞信号、磷脂脱磷酸作用、脑桥发育、T细胞介导的细胞毒性的正调控、细胞粘附、突触组装调控等，主要集中在了物质代谢和细胞过程及神经的发育过程。在MF上的条目有信号传感器活性、跨膜信号受体活性、分子传感器活性、信号受体活性、细胞外配体在门控离子通道活性中的作用、配体−门控离子通道活性，主要集中在蛋白质的连接和催化活性上，在CC上的条目有受体复合物、终扣、神经递质受体复合物、亲离子谷氨酸受体复合物、质膜受体复合物、外质膜等。

在KEGG通路富集分析（图18，C）上面，富集到的条目包括有mRNA检测通路、尼古丁成瘾、神经受体配体作用和肌萎缩侧索硬化症（ALS），在REACTOME中富集到的前20条目分别为代谢、柠檬酸(TCA)循环与呼吸电子传递、PI代谢、脂质代谢、RAF/MAP 激酶级联、细胞蛋白的凋亡分裂、质膜上PIPs的合成、磷脂代谢、RUNX2表达和活性的调节、呼吸电子传递链、化学渗透偶联产生ATP，解偶联蛋白产生热量、免疫系统、细胞对压力的反应、caspase介导的细胞骨架蛋白的裂解、蛋白质代谢、DVL降解、Hedgehog信号通路配体、蛋白酶体GLI1降解、GLI3被蛋白酶体加工成GLI3R、泛素蛋白酶、翻译后的蛋白质修饰、氨基酸及其衍生物的代谢等等机制上发生了亚硝基的蛋白水平改变。

在PPI分析时（图18，D），其中degree值较高的蛋白有Ras-related蛋白质Rab-1A、Rab-5A，谷氨酸受体NMDA 2B、NMDA 1、kainate 2，E3泛素蛋白连接酶RBX1，血影蛋白α、β链，热休克同源蛋白71 kDa，真核起始因子4A-III、胞质动力蛋白1中间链、40S核糖体蛋白S8、NADH脱氢酶[泛醌]1 -复合物亚基7、丝氨，酸/苏氨酸-蛋白磷酸酶PP1β和γ催化亚基、一般囊泡运输因子p115、突触相关蛋白102，线粒体Rho GTPase 1、卵裂和聚腺苷酸特异性因子亚单位1、Coatomer γ亚基等等。

图18 M组和TMP组亚硝基化蛋白的差异分析结果

2.7.3 M组与AS的差异蛋白及分析

M组与TMP组共有361个差异蛋白进行分析，其中上调蛋白有50个，下调有311个，差异倍数较大的相对M组上调的蛋白有Schlafen家族蛋白8、角蛋白细胞骨架II型、蛋白磷酸酶1调节亚基、神经丛蛋白A1、线粒体载体同系物1等，下调的有嘌呤敏感氨基肽酶、piccolo蛋白、血浆铜蓝蛋白、M型肌酸激酶、热休克蛋白105kd、潜在的G蛋白偶联受体等。

将全部差异蛋白进行聚类热图分析（图19，A），两组样品在上调和下调蛋白均颜色差异鲜明证明样品组内重复性较高，而组间差异较大，证明样品的可信度。对于AS与M组的GO富集（图19，B），我们得到了在BP上的条目有mRNA的代谢过程、钙离子介导的信号通路、蛋白复合物稳定调控、微管锚定、突触后调控、mRNA过程、磷酸酶活性的负调控等，在MF上有条目有跨膜信号受体活性、分子传感器活性、信号受体活性、内切酶活性、磷酸酶活性；在CC上富集到的条目有吞噬小泡、核体、路易小体、皮质细胞、细胞后缘等。

在KEGG的信号通路富集中（图19，C），富集到了剪接体和系统性红斑狼疮相关通路，而REACTOME通路，富集到了代谢、mRNA剪接、含帽内含子Pre-mRNA的加工、膜运输、细胞对压力的反应、免疫、COPI介导的顺行运输、细胞凋亡、Golgi-to-ER逆行运输、RAB酰化、RNA代谢、蛋白质代谢、翻译、适应性免疫、柠檬酸(TCA)循环与呼吸电子传递、Rho GTPases发送信号、GTPase效应物、氨基酸合成与相互转化(转胺)等方面的通路。

继而进行的PPI分析（图19，D）在所有差异蛋白中寻找关键蛋白，AS与M组之间差异蛋白按照degree排序得到蛋白如下：热休克同源蛋白71 kDa、40S 核糖体蛋白S3、S8、S16，U5小核核糖核酸蛋白组分、60S核糖体蛋白L23、L31、L6、L9，异质核糖核蛋白L、聚嘧啶tract结合蛋白1、Poly(rC)结合蛋白1，剪接因子U2AF 65 kDa亚基，mRNA前剪接因子ATP依赖性RNA解旋酶DHX15，富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子3，卵裂和聚腺苷酸特异性因子亚单位1、小核核糖核蛋白相关蛋白B、U5小核核糖核酸蛋白解旋酶、U5小核核糖核蛋白40kda蛋白、RNA结合蛋白质FUS、胞质动力蛋白1中间链等。

图19 M组和AS亚硝基化蛋白的差异分析结果

2.7.4 M组与青蒿琥酯川芎嗪组合的差异蛋白及分析

M组和AS+TMP组差异蛋白共有276个，其中上调蛋白具有75个，下调蛋白具有201个，其中差异倍数较大、相对M组上调的蛋白有配分缺陷3同系物B、激酶锚定蛋白7、Fbxo41、组蛋白H4、细胞周期与神经元分化蛋白等，而下调的有M型肌酸激酶、水通道蛋白4、小核核糖核蛋白相关蛋白B、NADP依赖苹果酸脱氢酶、早期核内体抗原1等。

将差异蛋白进行聚类热图分析显示，M组和AS+TMP组两组样本差异蛋白显示两组样本组间差异很大，组内差异小。GO富集分析BP上面有一氧化氮合酶的正向调控、胶质细胞再生、对细菌防御反应、负性调节淋巴细胞活化、内皮细胞迁移，在MF上的条目有底物−特异性通道活性、被动式转运体活性、通道活性、跨膜信号受体活性、离子门控通道活性，在CC上富集到的条目有质膜的成分、受体复合物、细胞膜的成分等。

在KEGG通路富集中，富集到了Ras信号通路、系统性红斑狼疮、酒精中毒、自噬、神经元受体配体相互作用、谷胱甘肽代谢。在REACOME通路中，富集到了神经突生长的NCAM信号、RAF/MAP 级联激酶、B细胞中Ras的激活、抗原处理:泛素化与泛素化蛋白酶体降解等。

使用PPI分析，degree值较高的蛋白有E3泛素蛋白连接酶RBX1、40S核糖体蛋白S19、60S核糖体蛋白L23、L6、GTPase Kras和HRas、真核起始因子4A-III、延伸蛋白C、谷氨酸受体NMDA 2B、NMDA 1、血影蛋白α链、Fbxl16、Fbxo41、Fbxo21（SKP1-CUL1-F-box蛋白型E3泛素连接酶复合物的底物识别组分）等。

图20 M组和AS+TMP组亚硝基化蛋白的差异分析结果

2.8亚硝基化蛋白质谱结果验证

对其他四组与M组的差异蛋白进行交集，使用venn图展示结果（如图21，A），其中M/C、TMP/M、AS/M和AT/M全部亚硝基化差异蛋白为0，而在M/C、TMP/M和AS/M为0，而在三组给药组之间有86个重叠蛋白，在M/C、AS/M和AT/M有共同差异蛋白为 热休克蛋白105 kDa，M/C、TMP/M和AT/M有丙酮酸脱氢酶E1组成蛋白（Pdhb），M/C和AS/M 共同蛋白是乙酰辅酶a乙酰转移酶，M/C和TMP/M共同蛋白是丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K，M/C和AT/M共同差异蛋白有4个内质网连接形成蛋白（Lnpk）、转铁蛋白、延伸蛋白C，40S核糖体蛋白S19等，其中选择两种已知蛋白功能及亚硝基化后蛋白作用活性的Pdhb和Lnpk来进行验证，验证结果如下（图21，B）Lnpk蛋白在正常蛋白表达时呈现各组表达水平相近，而在亚硝基化蛋白中，明显呈现在Control组与AS+TMP组表达相较于M组上调的趋势；在Pdhb正常蛋白相较于M组各组表达上调不明显，而在亚硝基化后与M组相比，Control组、TMP组、AS组和AS+TMP组表达均显示上调。

图21各组小鼠差异蛋白维恩图和脑部亚硝基化蛋白情况WB检测验证结果

3讨论

本研究使用恶性疟原虫Pb.ANKA株进行ECM小鼠模型构建，使用滴鼻给药，对各组的感染率、死亡率、体重和行为学评分等指标进行测定。实验结果证明，青蒿琥酯川芎嗪联合给药能够显著增加ECM小鼠的生存率、降低感染率，能改善ECM导致的体重下降，能改善ECM导致的神经功能障碍如探索活动能力下降、共济失调、偏瘫、昏迷等。青蒿琥酯川芎嗪联合给药对ECM症状的改善，与它能改善多种ECM病理状态有关。青蒿琥酯川芎嗪组合能够减轻脑微血管的pRBC和淋巴细胞的堵塞，减少退化神经元，改善凝血障碍，减轻脑内粘附因子受体ICAM1和VCAM1的表达。青蒿琥酯川芎嗪组合联合给药能够缓解多项ECM导致的病理过程，可以作为CM辅助治疗药物的新选择。

动物饲养于中国中医科学院中药研究所SPF级洁净环境，饲养期间给予动物标准饲料和自由洁净饮水。本动物实验遵守国际实验动物伦理学要求。

尽管实验脑型疟（ECM）模型与人脑型疟并不完全一致，但他们都具有相同的症状表现，包括偏瘫，癫痫，昏迷等，并且在组织病理学上都具有脑微血管阻塞，脑出血，血管内皮功能障碍等，ECM概括了在大多数严重疟疾综合征中观察到的症状和病理学特点。因此，通过C57BL/6J小鼠接种伯氏疟原虫P.berghei ANKA 建立ECM模型，为研究脑型疟辅助疗法，特别是对神经功能的改善作用的药效评价创制条件。模型构建实验结果表明，接种疟原虫的模型组小鼠体重下降，16 天内全部死亡。体外HE染色可见血管内染虫红细胞和白细胞粘附、脑组织局部出血，与文献报道一致。RMCBS评分观察期间可见，小鼠逐渐出现走路不稳，共济失调，皮毛卷曲，弓背等体征，脚趾反应下降和耳廓反射消失，抽搐，昏迷症状直至死亡，小鼠表现出CM症状，且RMCBS进行的评分结果与小鼠状态一致，通过尾尖取血发现伴随贫血，提示ECM模型建立成功。RMCBS作为一种预测和评价小鼠CM神经功能评价指标，重复性，客观性、可比性好，也为基于改善脑型疟神经损伤后遗症的辅助治疗手段和新药研发奠定基础。

1.评价指标体系

1）基础考察指标：感染率、体重、体温、小鼠昏迷及行为量表评分（RMCBS）

2）病理检测：HE检测脑部各分区微血管堵塞情况、FJB及尼氏检测脑部神经元凋亡水平、镀银染色检测脑部神经纤维情况；伊文思蓝染色、电镜检测大脑皮层及血脑屏障

3）活体检测：脑血流情况、脑部核磁MRI

4）分子水平检测

(1) 堵塞情况及：ICAM1、VCAM1和CD36等

(2) 血脑屏障：ZO-1、claudin-5等表达水平

(3) NO及相关NOS表达

(4) 神经损伤情况：GFAP、BDNF等

2. 国内外现有模型的异同

利用伯氏疟原虫PbA感染C57BL/6J小鼠的实验性脑型疟疾（ECM）模型已被广泛应用于探讨CM的发病机制，该ECM模型与人脑型疟有较多相似之处，包括染疟红细胞的隔离，微血管堵塞，免疫细胞聚集等。国内外文献在对其模型的疟原虫接种量、评价指标、发病机制等方面存在一定差异，用来研究CM的仅有Plasmodium Yoelii和 Plasmodium Berghei两种疟原虫株。其中Plasmodium Berghei是所有疟原虫株中能引起小鼠、仓鼠和大鼠CM的虫株，Plasmodium BergheiSP11，ANKA，NK65，K173都曾被用来研究CM。Grau等人利用PbA在CBA/Ca小鼠中的多克隆系和细胞因子单克隆或多克隆抗体证明了γ干扰素（IFN-g）、TNF-a、IL-3和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的参与[1]，Hermsen等人报道循环TNF-a不参与感染Plasmodium Berghei K173的C57BL/6小鼠ECM的发展。由PbA多克隆系衍生的多个克隆系均可引起ECM，但ECM诱导程度与接种量有关。研究人员还观察到ECM特征（生存时间和低温）存在细微的差异。由于PbA株能引起CM小鼠神经症状，因此它是脑型疟疾研究中最常见的毒株，即从2000年到2008年，只有5项CM研究使用了Pb K173，相比之下，PbA有97项。CM易感小鼠系包括CBA/J、CBA/HN、C57BL/6J，C57BL/6N、SLJ/J、Swiss等， CM中129研究在C57BL/6J或C57BL/6N小鼠完成，其他敏感小鼠 （CBA/ca、CBA/ J、CBA/HN、SLJ/J、129/Ola、Swiss和NMRI）的使用频率较低，但Pb ANKA感染C57BL/6J小鼠能更好地复制人类CM病理特征，如脑微血管阻塞、脑水肿、神经功能受损、血管内皮功能障碍等，成为疟疾生物学家最有吸引力的选择。但是这些PbA感染小鼠模型更多地关注动物免疫及炎症病理，即主要的测定指标有感染率、体重、死亡率等，另有血脑屏障、炎症因子、免疫激活等相关指标。

本研究通过优化PbA感染剂量、C57BL/6J小鼠性别及体重和感染寄生虫接种量及其特定生活周期，能很好地复现并模拟人类CM神经功能障碍等一系列神经体征，如偏瘫、昏迷及抽搐，并且在组织病理学上能复现脑微血管阻塞、脑出血、血管内皮功能障碍等。同时，我们探究了脑型疟神经损伤的病理机制及药物改善神经功能的药理机制，验证了pfEMP1在脑型疟致病过程中的病理作用，并揭示了药物通过NO介导的蛋白亚硝基化修饰途径发挥保护ECM小鼠神经及血管功能的药理作用。

3. 技术难点

（1）动物的选择。本实验采用C57BL/6J小鼠进行实验，为了验证不同性别小鼠对实验结果的影响，本实验同时利用雌、雄小鼠进行实验，发现雄性小鼠有明显的ECM特征，即使用雄性16-18g小鼠更易成模，性别和体重是造模成功与否的一个关键因素。

（2）疟原虫接种量的选择。本实验通过筛选接种量1×104、1×105、1×106、1×107，评估小鼠神经体征变化，如昏迷、抽搐、偏瘫、粗毛、共济失调，根据CM临床症状，选择1×106疟原虫做为建模接种量，为造模成功提供了基础。

（3）小鼠脑型疟的成模率及死亡率。由于脑型疟模型一旦构建成功，小鼠便很快死亡，因此，我们需要对其进行密切观测及行为学检查，当发现行为异常时，及时采取措施进行后续的指标检测。

4. 创新性

（1）采用多种方法对实验性脑型疟模型进行评价，使用小鼠昏迷及行为量表评分RMCBS与活体脑血流检测、核磁检测等手段结合评价小鼠神经功能，分别从宏观和微观层面对脑部功能进行监测，且使用方法均接近临床评价手段；

（2）本实验利用脑型疟模型评价自主筛选药物青蒿琥酯-川芎嗪组合物，该组合药物已经申请专利3项，其中授权国际专利1项，授权国内专利1项，说明利用本模型能够筛选与评价脑型疟辅助治疗药物，为新药研发做贡献。

（3）利用生物化学与分子生物学手段探究了脑型疟神经损伤的病理机制及药物改善神经功能的药理机制，验证了pfEMP1在脑型疟病理过程中的作用，药物通过NO介导的蛋白亚硝基化修饰途径发挥保护ECM小鼠神经及血管功能的作用。

5. 应用价值

采用伯氏疟原虫PbA感染C57BL/6J小鼠构建实验性脑型疟模型，能够较好地模拟人脑型疟CM的神经损伤特征，即CM神经功能障碍等一系列神经体征，如偏瘫、昏迷及抽搐，并且在组织病理学上能复现脑微血管阻塞、脑出血、血管内皮功能障碍等，该模型可用于研究脑型疟发病机理、发现脑型疟新型辅助药物，并能够对神经功能有改善作用的药物进行药效评价。因此，该模型为研究脑型疟发病机制及脑型疟辅助药物药效评价提供了一个可操作用稳定可控的动物模型。