Nipsnap1基因敲除肺结核小鼠模型

一、疾病概述

肺结核（Pulmonary tuberculosis，PTB）是世界高死亡率的严重传染病之一。PTB是由各种分支杆菌菌株引起的，结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）大多在人类中观察到。根据世界卫生组织（世卫组织）的报告，2017年全世界有1000万新病例PTB疾病和150万例死亡（世卫组织，2018年）。 据估计，世界人口的三分之一是潜伏性感染的Mtb，其中5%至10%会发展为活动性结核病。

主要症状为有较密切的结核病接触史，起病可急可缓，多为低热（午后为著）、盗汗、乏力、纳差、消瘦、女性月经失调等；呼吸道症状有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、不同程度胸闷或呼吸困难。肺部体征依病情轻重、病变范围不同而有差异，早期、小范围的结核不易查到阳性体征，病变范围较广者叩诊呈浊音，语颤增强，肺泡呼吸音低和湿啰音。晚期结核形成纤维化，局部收缩使胸膜塌陷和纵隔移位。在结核性胸膜炎者早期有胸膜摩擦音，形成大量胸腔积液时，胸壁饱满，叩诊浊实，语颤和呼吸音减低或消失。 尽管有微生物治疗，多达一半的结核病幸存者仍具有某种形式的持续性肺功能障碍。肺功能障碍，从轻微异常到严重气喘，可增加呼吸道原因死亡的风险。快速诊断和有效治疗对于控制PTB的传播和降低其死亡率非常重要。尽管对PTB的机理研究开展了了大量工作，但PTB进展中的分子机制仍然不清楚。二、模型背景1、Nipsnap1基因信息• 敲除基因名称（NCBI号）：18082• 敲除基因NCBI网址链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/18082• 敲除基因名称：Nipsnap1• 敲除基因Ensembl网址链接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000034285;r=11:4873951-4894200• 方案针对的转录本（Ensembl号）：ENSMUSG000000342852、实验动物背景信息所采用的小鼠品系为C57BL/6。来源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57号与雄鼠52号交配而得C57BL1937年从C57BL分离出C57BL/6和C57BL/10两个亚系。1985年从Olac引到中国医学科学院实验动物研究所。毛色：黑色。主要特性：①乳腺肿瘤自然发生率低，化学物质难以诱发乳腺和卵巢肿瘤。②12%有眼睛缺损;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%为小眼或无眼。用可的松可诱发腭裂，其发生率达20%。③对放射物质耐受力中等;补体活性高;较易诱发免疫耐受性。④对结核杆菌敏感。对鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干扰素产量较高。⑥嗜酒精性高，肾上腺素类脂质浓度低。对百日咳组织胺易感因子敏感。⑦常被认作"标准"的近交系，为许多突变基因提供遗传背景。主要用途：是肿瘤学、生理学、免疫学、遗传学研究中常用的品系。3、研究背景 迄今已鉴定4个NIPSNAP家族蛋白：NIPSNAP-1和-2以及NIPSNAP-3和-4。NIPSNAP家族蛋白含有两个结构域：4-硝基苯磷酸酶域和非神经性SNAP25类蛋白质同源结构域。研究主要涉及癫痫发作，苯基酮尿症，和阿尔茨海默病等。NIPSNAP-1在大脑中的高水平上表达，肝脏和肾脏(1-3)。比对多个物种的NIPSNAP家族基因序列，揭示了NIPSNAP家族基因序列的高度保守性，提示其关键生物学功能。 NIPSNAP-1可局部化到外线粒体膜和内膜空间，并与细胞索蛋白（如P62/SQSTM-1和ATG8s(4)相互作用。因此，NIPSNAP-1可充当支架蛋白，在先天免疫反应期间在线粒体相关信号转导中发挥作用。与炎症相关的慢性疼痛是一个重要的临床问题，其基本机制仍然缺乏理解。NIPSNAPs表达的变化可能有助于炎症性疼痛的发病机制(5)。 研究表明线粒体蛋白NIPSNAP -1和-2和长链acyl-CoA脱氢酶（VLCAD）作为抗生素clarithromycin结合蛋白。在人类上皮细胞系BEAS-2B和T24中，由脂质多糖和Pam3-CSK4诱导的致炎细胞因子（IL-8和IL-6）的产生被NIPSNAP-1或-2 的所抑制。此外，在各种细胞系中敲除NIPSNAP-1抑制了IL-8和IL-6 mRNA和NF-βB活性的LPS诱导表达(6)。参考文献：1. Nautiyal M, Sweatt AJ, MacKenzie JA, Mark Payne R, Szucs S, Matalon R, Wallin R, Hutson SM. Neuronal localization of the mitochondrial protein NIPSNAP1 in rat nervous system. Eur J Neurosci. 2010 Aug;32:560-9.2. Seroussi E, Pan HQ, Kedra D, Roe BA, Dumanski JP. Characterization of the human NIPSNAP1 gene from 22q12: a member of a novel gene family. Gene. 1998 May 28;212:13-20.3. Schoeber JP, Topala CN, Lee KP, Lambers TT, Ricard G, van der Kemp AW, Huynen MA, Hoenderop JG, Bindels RJ. Identification of Nipsnap1 as a novel auxiliary protein inhibiting TRPV6 activity. Pflugers Arch. 2008 Oct;457:91-101.4. Behrends C, Sowa ME, Gygi SP, Harper JW. Network organization of the human autophagy system. Nature. 2010 Jul 1;466:68-76.5. Okuda-Ashitaka E, Minami T, Tsubouchi S, Kiyonari H, Iwamatsu A, Noda T, Handa H, Ito S. Identification of NIPSNAP1 as a nocistatin-interacting protein involving pain transmission. J Biol Chem. 2012 Mar 23;287:10403-13.6. Yamamoto S, Ogasawara N, Yamamoto K, Uemura C, Takaya Y, Shiraishi T, Sato T, Hashimoto S, Tsutsumi H, et al. Mitochondrial proteins NIP-SNAP-1 and -2 are a target for the immunomodulatory activity of clarithromycin, which involves NF-kappaB-mediated cytokine production. Biochem Biophys Res Commun. 2017 Feb 12;483:911-6.

1.guideRNA设计

guideRNA信息:

Nipsnap1（ko） -sgRNA1： CCACAAGGTGGATCCTCGGAAGG

Nipsnap1（ko） -sgRNA1： CAACGTGAAGCCCGAATGTCTGG

Nipsnap1缺失小鼠鉴定结果图：

图1.Nipsnap1缺失小鼠鉴定结果。

通过送测序，鉴定。杂合子：一条缺失8bp，为双峰；纯和子：两条缺失8bp，为单峰。

模型动物饲养在武汉大学人民医院动物房SPF级动物实验室，实验动物使用许可证SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特点

门采用专用净化密闭门并配备观察窗。单向走道呈顺时针走向设计。屏障系统内共有大鼠饲养室1间，小鼠饲养室3间，隔离观察室1间，实验准备室1间，洁物存放室1间，清洗消毒室1间。此外，屏障系统外配有监控室、机房和配电室等。

（2）设计参数

室内温度：20～26°C；日温差：≤4°C；相对湿度：40%～70%；换气次数：15～20次/h；气流速度：≤0．2m/s；压强梯度：20～50Pa；空气洁净度：7级；菌落数：≤3个/皿；氨浓度：≤14mg/m3；噪声：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；动物照度：15～20lx；昼夜明暗交替时间：12/12h。

（3）通风和空调系统

动物实验室采用全新风中央空调通风系统。空气经过初、中、三级过滤器后进入实验室内环境。

（4）照明系统

一更、淋浴、二更、气闸、清洁走道、洁物存放处、污物走道、缓冲间和清洗消毒间、动物饲养室、实验准备间、隔离观察室和功能实验室等安装有手动和自动开关，根据实际需要，调节控制室内照明灯。未启用房间、清洁走道、洁物存放处、污物走道等在每日中午12点和晚上8点开启紫外线灯照射1h。

（5）通讯系统

因为SPF级动物实验室的环境和设施具有特殊要求，人员进入后不能随意出入，而室内外的联系又十分重要，故室内各房间均安装内部电话机，按照房间顺序编排电话号码，各室内电话可相互连通，并均与监控室总机保持联系，保证实验室内外信息的及时沟通。

（6）监控系统

对SPF级动物实验室的出入口、走道、实验动物饲养室、功能操作室等重要位置均安装了可作270°旋转的摄像机，能够及时了解设施的运行状态；也能有效督促实验人员执行科学的操作规程，避免人为因素造成室内环境和设施的污染；并对整个实验期间的动物状态和反应进行观察，减少对动物的滋扰。

（7）供水系统

SPF级实验动物饮用水以纯净水为宜。本实验室采用管道供水，将处理后的纯净水用塑胶管道输送到屏障系统内实验准备室，设置接水槽，为实验动物供应灭菌的饮用水和屏障系统内用水。要经常更换和清洗输水管道，清洗笼具的用水添加适当比例的84消毒液。

（8）供电系统、警报系统和消防设施

SPF级动物实验室要求全天候不间断供风和供电，如果出现故障，不能及时发现和处理，就可能导致环境设施的污染、动物感染或死亡，造成严重后果。因此应对SPF级动物实验室使用独立稳定的供电系统，并配备有应急电源。在中央空调机房控制室安装风机故障警报系统，以便及时检修和维护，保证设施的安全运行。

（9）消毒灭菌设备

为防止外界物品进入SPF级动物实验室时所携带的细菌污染室内环境和造成动物交叉感染，按照不同物品的特性，进行紫外线照射消毒、渡槽消毒液消毒或专用的机动门真空灭菌器消毒。

（10）动物饲养笼具

饲养大、小鼠的笼具聚碳酸脂材料的塑胶笼具，具有高透明、耐高压、耐高温、耐酸碱等特点。通用的不锈钢笼具长、宽、高分别为40、30、20cm，适用于单笼饲养有特殊要求的实验动物，配有底盘和食槽，确保实验动物有充足的采食和活动空间，同时也保证室内环境的清洁。

（11）垫料的选择和使用

在使用塑胶垫料时，垫料是大小鼠直接接触的铺垫物，起到吸湿、保暖和造窝的作用。垫料的好坏直接影响到大小鼠术后的恢复、生长发育和繁殖性能。目前，所使用的垫料主要有玉米秸垫料、刨花垫料。

（12）饲料配制

大小鼠的生产型饲料和维持型饲料必须严格按照国家标准，进行科学配制生产。每半年检测一次饲料的微生物指标和有效营养成分指标，保证饲料的质量。

Nipsnap1基因敲除小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技术的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外显子或几个总要的外显子功能区敲除掉，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。Armh4基因敲除小鼠模型为完全性基因敲除模型（KO），该模型应用范围广，可以制造针对各类疾病不同组织器官细胞的疾病模型。

CRISPR/Cas9技术的优点在于其对基因进行定位的精准编辑，在向导RNA（guide RNA，gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，细胞基因组DNA（被看成外源DNA）将被准确剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要满足几个条件。第一，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（NGG）。第二，向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。