Cilp2基因敲除心脏衰老小鼠模型

一、疾病概述 健康、衰老和寿命是人们最关心的问题，自古以来人们也一直在探索其中的奥秘。随着我国进入老龄化社会，年龄增长带来的疾病严重威胁人类的健康，但是目前对于衰老的认识还处于初步阶段。衰老引起的左心室纤维化、僵硬和室壁增厚，均会引起心肌舒张功能障碍，导致心力衰竭。在衰老的心脏中，心肌细胞的数量可能会随着年龄的增长而减少，但心脏成纤维细胞会明显增殖，它可以产生细胞外基质和胶原蛋白。心肌成纤维细胞增殖过多时，会出现胶原的合成与降解失衡，胶原比例失衡、细胞排列紊乱，细胞外基质沉积，这是诸多心血管疾病发展到一定阶段共同的病理变化。 目前，心脏衰老及其导致的心肌肥厚的发病机理尚未完全阐明，临床上缺乏有效的药物治疗手段。因此，探索心脏衰老和衰老性心肌肥厚病理发生的分子机制有助于寻找新的药物作用靶点，改进抗心脏衰老和衰老性心肌肥厚的治疗方案，并推动精准医疗在心脏衰老防治领域的发展。二、模型背景1、Cilp2基因信息• 敲除基因名称（NCBI号）：68709• 敲除基因NCBI网址链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/68709• 敲除基因名称（MGI号）：Cilp2（MGI: 1915959）• 敲除基因Ensembl网址链接：• http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000044006;r=8:69880369-69887687;t=ENSMUST00000057831• 方案针对的转录本（Ensembl号）：ENSMUST00000057831.7• 方案敲除的exon：exon 4~62、实验动物背景信息 所采用的小鼠品系为C57BL/6。 来源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57号与雄鼠52号交配而得C57BL1937年从C57BL分离出C57BL/6和C57BL/10两个亚系。1985年从Olac引到中国医学科学院实验动物研究所。 毛色：黑色。 主要特性：①乳腺肿瘤自然发生率低，化学物质难以诱发乳腺和卵巢肿瘤。②12%有眼睛缺损;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%为小眼或无眼。用可的松可诱发腭裂，其发生率达20%。③对放射物质耐受力中等;补体活性高;较易诱发免疫耐受性。④对结核杆菌敏感。对鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干扰素产量较高。⑥嗜酒精性高，肾上腺素类脂质浓度低。对百日咳组织胺易感因子敏感。⑦常被认作"标准"的近交系，为许多突变基因提供遗传背景。 主要用途：是肿瘤学、生理学、免疫学、遗传学研究中常用的品系。3、研究背景 衰老，系指随着时间的增加，生命体功能衰退的过程[1]。寿命长用做低等模式生物评价衰老最重要的指标；而在高等动物中，细胞、组织与器官结构与功能复杂，单纯用寿命作为衰老的唯一指标并无全面，有研究认为，改善衰老相关疾病被认为是减轻衰老的表现[2, 3]。衰老相关的系统性疾病包括：心脑血管疾病、肿瘤、骨关节炎、糖尿病与神经退行性疾病；相关研究也通常会记录衰老相关疾病的状态来评价个体衰老的情况[4]。宏观的生命体系统特征往微观的细胞与分子活动的表现形式，若透过衰老的生物学特征寻找到衰老的细胞、分子调控机制对于延缓衰老至关重要。经典的细胞衰老是指一种不可逆的细胞周期阻滞机制，相关因素包括：端粒缩短，DNA损伤，活性氧累积，原癌基因与抑癌基因异常活动，代谢改变，未折叠蛋白反应，炎性因子长期刺激，有丝分裂异常造成的应激压力等[5]。 目前，衰老研究领域也大致分为应激适应、表观遗传、炎症、生物大分子损伤、新陈代谢、蛋白稳态、干细胞与再生七大类[6]。此外，被深入研究过的分子包括p53、p21、p14ARF、p19ARF和p16INK4A因其在衰老过程中发挥了重要作用，已被普遍用作鉴定衰老的标志物[7]。 软骨中间层蛋白（cartilage intermediate layer protein，Cilp）主要分布在软骨细胞中，多个组织中均能表达，其中心脏、中枢系统、骨骼肌表达水平较高。目前，关于CILP的研究较少，其中主要涉及骨关节炎、腰椎间盘突触，研究发现Cilp1与Cilp2与衰老相关疾病骨关节炎相关，Cilp1对骨关节炎有损害而CiLp2对其却有保护作用[8, 9]。此外，另有研究报道[10-12]Cilp1在缺血-再灌注损伤模型中，Cilp1在脉及左心室中的mRNA和蛋白质的表达水平显著升高，Cilp1可通过抑制TGF-β1/SMAD信号通路来抑制成纤维细胞的活化。与Cilp1类似，Cilp2一部分研究主要集中在Cilp2及其单核苷酸基因多态性位点与在骨关节炎的关系；有研究[13]确定了Cilp-2和Pepck存在直接相互作用，并认为Cilp-2在调节肝脏葡萄糖产生中起着重要作用。另有研究发现，Cilp2基因的小t等位基因多态性对血脂和脂蛋白水平的升高有保护作用[14]。 本研究通过前期质谱结果发现，Cilp2在老年人血浆中的蛋白水平显著降低；此外，通过对衰老小鼠注射Cilp2病毒，发现Cilp2能改善小鼠的心功能。而目前尚未报道Cilp2在衰老心脏过程中的作用，因此本项目拟探究Cilp2对心脏衰老的影响及探究其潜在的分子机制。参考文献：1. Lopez-Otin, C., et al., The hallmarks of aging. Cell, 2013. 153(6): p. 1194-217.2. Kaeberlein, M., M. McVey, and L. Guarente, The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev, 1999. 13(19): p. 2570-80.3. Rogina, B. and S.L. Helfand, Sir2 mediates longevity in the fly through a pathway related to calorie restriction. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(45): p. 15998-6003.4. Childs, B.G., et al., Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nat Rev Drug Discov, 2017. 16(10): p. 718-735.5. van Deursen, J.M., The role of senescent cells in ageing. Nature, 2014. 509(7501): p. 439-46.6. Kennedy, B.K., et al., Geroscience: linking aging to chronic disease. Cell, 2014. 159(4): p. 709-13.7. Sharpless, N.E. and C.J. Sherr, Forging a signature of in vivo senescence. Nat Rev Cancer, 2015. 15(7): p. 397-408.8. Bernardo, B.C., et al., Cartilage intermediate layer protein 2 (CILP-2) is expressed in articular and meniscal cartilage and down-regulated in experimental osteoarthritis. J Biol Chem, 2011. 286(43): p. 37758-67.9. Yao, Z., et al., Characterisation of cartilage intermediate layer protein (CILP)-induced arthropathy in mice. Ann Rheum Dis, 2004. 63(3): p. 252-8.10. Zhang, C.L., et al., Cartilage intermediate layer protein-1 alleviates pressure overload-induced cardiac fibrosis via interfering TGF-beta1 signaling. J Mol Cell Cardiol, 2018. 116: p. 135-144.11. Barallobre-Barreiro, J., et al., Proteomics analysis of cardiac extracellular matrix remodeling in a porcine model of ischemia/reperfusion injury. Circulation, 2012. 125(6): p. 789-802.12. Zhang, C., et al., Genetic determinants of childhood and adult height associated with osteosarcoma risk. Cancer, 2018. 124(18): p. 3742-3752.13. Wu, T., et al., CILP-2 is a novel secreted protein and associated with insulin resistance. J Mol Cell Biol, 2019. 11(12): p. 1083-1094.14. Luptakova, L., et al., Association of CILP2 and ACE gene polymorphisms with cardiovascular risk factors in Slovak midlife women. Biomed Res Int, 2013. 2013: p. 634207.

1. 项目策略图 此模型采用CRISPR/Cas9技术对Crtc1基因进行基因编辑，原理示意图如下：

2. 项目策略概述 利用CRISPR/Cas9技术，设计并体外转录gRNA, 将Cas9、gRNA同时注射到小鼠的受精卵中。Cas9蛋白在gRNA引导下结合到靶位点进而造成DNA双链断裂，从而实现靶位点碱基序列缺失，实现基因敲除。3. gRNA序列信息gRNA1: GCTGTTCAGGATGGGCCAAT (5’ – 3’), PAM: GGG.gRNA2: ACAAGCAGAGCAGGTGGGCG (5’ – 3’), PAM: GGG.4. 建立主动脉缩窄建立小鼠心肌肥厚模型（TAC手术），通过超声心动图评价心脏功能，小鼠采用异氟脘吸入麻醉，将小鼠左胸前区剃毛，涂抹耦合剂，取仰卧位对小鼠行超声检查。采用高频超声诊断仪（VET V6，VINNO，中国），频率为12.5 MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量各项指标。5．小鼠心脏组织切片形态及病理检测 称取小鼠体重，小鼠经心脏灌注，取出心脏后用滤纸吸干血液后称重，计算心脏重量与体重的比值（Heart weight/body weight，HW/BW）。6．心肌肥厚分子标志物检测将各实验组小鼠心室肌组织分别提取总RNA，应用qPCR检测心肌肥厚指标Anp、Bnp、Myh6、Myh7的mRNA水平。

1. 小鼠鉴定结果解读

图1.鉴定结果图。27#，30#，19# KO- PCR 反应可以获得~559bp条带； WT- PCR 反应可以获得422bp 条带，为杂合子。16# KO- PCR 反应未获得~559bp条带； WT- PCR 反应可以获得422bp 条带，为野生型。注：数字为鼠尾号，WT为C57BL/6J野生鼠，N为Negative空白对照，M为DNA Marker。2. Cilp2在衰老后表达水平下降 与年轻组相比，男性与女性老年人血浆中Cilp2蛋白水平有显著降低的趋势，表明Cilp2在衰老过程可能发挥了作用（图2）。

图2：血浆中年轻人和老年人血浆中的Cilp2蛋白质水平。3. Cilp2过表达会改善衰老性心肌肥厚 通过构建Cilp2重组腺相关病毒，尾静脉注射至衰老小鼠构建Cilp2过表达组。我们发现，衰老小鼠的体重与心重与年轻组明显增加，而Cilp2过表达组与衰老组相比，心脏重量及心脏重量与胫骨长比值显著降低(图3A)。此外，通过小动物超声机检测各组小鼠的新功能，我们发现左心室舒张末期直径(LVSd), 左室后壁厚度(LVPWd)在衰老组显著增高，表明在衰老后心功能下降；而过表达Cilp2后发现，LVPWd虽没有统计学差异，但有下降的趋势，表明Cilp2可以部分减缓衰老过程中的心功能下降(图3B)。

图3.Cilp2对衰老心脏功能的影响。（A）体重、心脏重量和心脏重量/肱骨长的差异比较。（B）超声检测三组小鼠的LVSD和LVPWd的差异。4. Cilp2对病理性心肌肥厚的影响 通过qRT-PCR检测心肌肥厚分子标志物发现，与年轻心脏的Cilp2 mRNA水平相比，衰老心脏的Cilp2 mRNA水平呈下降趋势,过表达组Cilp2 mRNA 显著增高（图3）。与病理性的心肌肥厚不同，衰老后的心脏Anp、Bnp无显著升高；而Mhy6 mRNA 水平下降，Mhy7 mRNA水平升高与病理性心肌肥厚一致。Cilp2过表达组有逆转Mhy6的趋势（图3）。

图3 通过qRT-PCR检测Cilp2、Anp、Bnp、Myh6和Mh7的mRNA水平。

模型动物饲养在武汉大学人民医院动物房SPF级动物实验室，实验动物使用许可证SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特点

门采用专用净化密闭门并配备观察窗。单向走道呈顺时针走向设计。屏障系统内共有大鼠饲养室1间，小鼠饲养室3间，隔离观察室1间，实验准备室1间，洁物存放室1间，清洗消毒室1间。此外，屏障系统外配有监控室、机房和配电室等。

（2）设计参数

室内温度：20～26°C；日温差：≤4°C；相对湿度：40%～70%；换气次数：15～20次/h；气流速度：≤0．2m/s；压强梯度：20～50Pa；空气洁净度：7级；菌落数：≤3个/皿；氨浓度：≤14mg/m3；噪声：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；动物照度：15～20lx；昼夜明暗交替时间：12/12h。

（3）通风和空调系统

动物实验室采用全新风中央空调通风系统。空气经过初、中、三级过滤器后进入实验室内环境。

（4）照明系统

一更、淋浴、二更、气闸、清洁走道、洁物存放处、污物走道、缓冲间和清洗消毒间、动物饲养室、实验准备间、隔离观察室和功能实验室等安装有手动和自动开关，根据实际需要，调节控制室内照明灯。未启用房间、清洁走道、洁物存放处、污物走道等在每日中午12点和晚上8点开启紫外线灯照射1h。

（5）通讯系统

因为SPF级动物实验室的环境和设施具有特殊要求，人员进入后不能随意出入，而室内外的联系又十分重要，故室内各房间均安装内部电话机，按照房间顺序编排电话号码，各室内电话可相互连通，并均与监控室总机保持联系，保证实验室内外信息的及时沟通。

（6）监控系统

对SPF级动物实验室的出入口、走道、实验动物饲养室、功能操作室等重要位置均安装了可作270°旋转的摄像机，能够及时了解设施的运行状态；也能有效督促实验人员执行科学的操作规程，避免人为因素造成室内环境和设施的污染；并对整个实验期间的动物状态和反应进行观察，减少对动物的滋扰。

（7）供水系统

SPF级实验动物饮用水以纯净水为宜。本实验室采用管道供水，将处理后的纯净水用塑胶管道输送到屏障系统内实验准备室，设置接水槽，为实验动物供应灭菌的饮用水和屏障系统内用水。要经常更换和清洗输水管道，清洗笼具的用水添加适当比例的84消毒液。

（8）供电系统、警报系统和消防设施

SPF级动物实验室要求全天候不间断供风和供电，如果出现故障，不能及时发现和处理，就可能导致环境设施的污染、动物感染或死亡，造成严重后果。因此应对SPF级动物实验室使用独立稳定的供电系统，并配备有应急电源。在中央空调机房控制室安装风机故障警报系统，以便及时检修和维护，保证设施的安全运行。

（9）消毒灭菌设备

为防止外界物品进入SPF级动物实验室时所携带的细菌污染室内环境和造成动物交叉感染，按照不同物品的特性，进行紫外线照射消毒、渡槽消毒液消毒或专用的机动门真空灭菌器消毒。

（10）动物饲养笼具

饲养大、小鼠的笼具聚碳酸脂材料的塑胶笼具，具有高透明、耐高压、耐高温、耐酸碱等特点。通用的不锈钢笼具长、宽、高分别为40、30、20cm，适用于单笼饲养有特殊要求的实验动物，配有底盘和食槽，确保实验动物有充足的采食和活动空间，同时也保证室内环境的清洁。

（11）垫料的选择和使用

在使用塑胶垫料时，垫料是大小鼠直接接触的铺垫物，起到吸湿、保暖和造窝的作用。垫料的好坏直接影响到大小鼠术后的恢复、生长发育和繁殖性能。目前，所使用的垫料主要有玉米秸垫料、刨花垫料。

（12）饲料配制

大小鼠的生产型饲料和维持型饲料必须严格按照国家标准，进行科学配制生产。每半年检测一次饲料的微生物指标和有效营养成分指标，保证饲料的质量。

动物症状观察：

表现为体重减轻、弓背竖毛，在回输后的一个月后死亡。